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牦牛乳是一种珍稀的浓缩乳资源,营养价值高,但目前开发与利用程度仍然较低,为了充分利用牦牛乳的营养成分,开发其功能性产品,本研究从腐乳汁中分离出一株高产蛋白酶菌株（Bacillus cereus.BG3-7）,以牦牛乳酪蛋白为原材料,对其发酵制备抗氧化肽,同时优化发酵条件,提高酪蛋白发酵液中抗氧化肽的活性,建立小鼠D-半乳糖氧化损伤模型,分析测试抗氧化肽在机体内的抗氧化活性,最后使用超滤、凝胶层析结合质谱对发酵液中的抗氧化肽进行分离纯化,确定氨基酸序列,同时结合傅里叶红外光谱和扫描电镜,探究抗氧化肽微观结构的变化。主要内容包括:（1）从市售腐乳汁中分离纯化出五株高产蛋白酶菌株,根据产蛋白酶能力的高低确定出最佳发酵菌株SK-01,分别从形态学、生理生化鉴定和分子生物学三个水平上对该菌株进行鉴定。基于16S r DNA系统发育树分析,发现菌株SK-01与蜡样芽孢杆菌处于同一分支,亲源关系最接近。扫描电镜发现,SK-01呈短杆状,长约1μm,且在第20h的时候完成对数生长期,进入迟缓期。采用响应面试验优化最佳培养基配方,发现当葡萄糖添加量为0.5%、蛋白胨为1.21%、磷酸氢二钾为0.59%时,菌落生物量最高为6.67×108CFU/m L,蛋白酶产量可达66U/m L。（2）以牦牛乳酪蛋白为原料,采用SK-01对其进行发酵制备抗氧化肽,进一步采用响应面法优化发酵条件。实验发现牦牛乳中蛋白质含量为4.50±1.25%、脂肪含量为3.29±0.94%、总灰分为0.61±0.32%、水分为86.19±1.54%;以DPPH自由基清除率和水解度为指标优化SK-01发酵牦牛乳酪蛋白的工艺参数,发现最佳发酵条件为p H为7.96、温度为32.44℃、接种量为6.99%时DPPH自由基的清除率最高为78.19±0.21%。（3）采用超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱依次分离纯化发酵法制备的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。结果显示,牦牛乳酪蛋白发酵液经超滤分离后可分为5个组分,分别为:A1（A1>50KD）、A2（10KD2<50KD）、A3（5KD3<10KD）、A4（A4<5KD）和A5（发酵液）,其中组分A4的DPPH自由基清除率最高,为81.00%,羟自由基清除率为73.46%、超氧阴离子清除率为77.34%。组分A4经过凝胶层析Sephadex G-50分离后仅有一个峰,经Sephadex G-25凝胶层析检测,纯化后产生3个峰F1、F2和F3,组分F1的DPPH自由基清除率最高,为84.00±0.82%。组分F1经Sephadex G-10产生两个峰H1和H2,H1的DPPH自由基清除率为86.37±1.24%,H2的DPPH自由基清除率为81.00±1.63%,质谱发现H1中含有11种肽片段。超滤后各组分（牦牛乳酪蛋白、10KD1<50KD、5KD2<10KD、X3<5KD）经扫描电镜下观察结果不一,发现原始酪蛋白质地紧凑,排列紧密,拥有典型的蜂巢离体结构,经过发酵过后,各组分微观结构表面清晰可见不同程度的改变,变成粗糙无固定形态的碎片,结合傅里叶变换红外光谱检测,发现抗氧化肽中氢键断裂明显,无规则卷曲增加,三螺旋结构遭到破坏的程度增加。（4）构建小鼠D-半乳糖氧化损伤模型,分析牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对氧化损伤小鼠的保护作用。测定小鼠脏器指数,观察各个脏器的HE病理切片,测定血清中氧化还原酶的活力以及抗氧化相关物质的含量,并进一步分析抗氧化肽对肝脏中SOD1、Catalase和GSH1基因在m RNA水平的表达量的影响。实验结果表明,牦牛乳酪蛋白抗氧化肽有助于缓解小鼠脏器指数的升高,与模型组相比,各实验组均可不同程度的降低小鼠血清中MDA的含量,其中低剂量组小鼠血清中MDA的含量最低,为0.03nmo L/m L;使SOD和CAT的酶活上升,中剂量组的SOD活性最高,为13.29U/m L,高剂量组的CAT酶活最高,为10.7U/g;中剂量组的总抗氧化能力为0.28μmo L/m L,GSH含量为13.34μg/m L;同时在m RNA水平上均可使SOD1、Catalase和GSH1的表达量上升,高剂量组SOD1的相对表达量为1.47;Catalase和GSH1的相对表达量正常组均最高,分别为0.98和1.06。