肺循环是一个低阻力、低压力和高流量系统，当其收缩压高于30mmHg(或平均压＞20mmHg)即为肺动脉高压(PAH)。此为临床上的严重病理状态，且病死率很高。其主要病理特点为肺小动脉内膜纤维化、中层平滑肌细胞肥大、外膜增生和血管内微血栓形成。病人常表现为进行性肺动脉压力增高，右心功能下降，最后导致右心衰竭而死亡。业已证实，PAH的发病与肺内内皮型一氧化氮合酶(eNOS)缺乏所致的一氧化氮(NO)产量降低有关。并且，临床上采用NO吸入治疗已取得显著效果，既可改善血流动力学且降低病死率，又对体循环血管无明显扩张作用。然而，NO价格昂贵、使用不便，并须用特殊的吸入装置，且半衰期短、易产生耐药现象，甚至可引发全身不良反应等而使其应用受到限制。Janssens等采用雾化吸入法在大鼠呼吸环路内的吸入相滴入AdCMVceNOS，首次实现了eNOS的肺内转移，并明显降低急性低氧诱发的肺动脉压增高，而不影响体循环血压。由此证实，eNOS基因导入即可达降低肺动脉压力的治疗作用。这不仅成为目前的研究热点，且很可能成为今后治疗PAH最有潜力的新方法。据目第四军医大学硕士学位论文前所知，实现外源基因导入从而治疗PAH的途径，可通过血管内皮、外膜以及呼吸道上皮等。本研究将感染复数(Mol)为30的重组腺病毒AdCMVceNOS和不同剂量的AdCMVLacZ，分别导入体外培养的人血管内皮细胞中和大鼠肺内，观察腺病毒介导的外源基因在体外和体内的转基因表达分布范围、时效性、量效关系及相关毒副作用，旨在为PAH的基因治疗提供实验依据。实验一腺病毒介导人类内皮型一氧化氮合酶基因在人离体血管内皮细胞中的表达 目的探讨腺病毒介导的人类eNOS基因在血管内皮细胞中表达和分泌NO的情况 方法(1) AdCMVceNOS病毒DNA用脂质体法体外转染293细胞，且在细胞内部包装。经多聚酶链式反应(P CR)鉴定后在293细胞株内扩增，继而经CsCI密度梯度离心纯化及TCID50法测定滴度;(2)采用改良Jaffe氏培养法体外原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并鉴定;(3)HUVECs随机分成Ad一eNOS组、Ad一Lacz组和空白对照组，每组巧个培养孔。换无$血清培养液后，分别给予Mol为30的AdeMve喇05、AdCMVLaez或等量培养液孵育Zhr。继而改用ro%FBS DMEM培养液继续孵育待检;(4)分别于第l、3、5天每组取5个培养孔，测定培养液上清NO含量。eNOS基因表达产物由小鼠eNOS单克隆抗体免疫组化定性。 结果(1) AdCMVceNOS病毒DNA经脂质体法成功导入293细胞内，并包装成完整的病毒颗粒。经PCR鉴定并确认，扩增后检测滴度为1.58xlol0PFU/ml;(2) Ad一eNOS组于病毒感染后1天即有阳性细胞表达，3天达高峰。胞浆内弥漫的褐色颗粒，第四军医大学硕_L学位论文表明AdCMVceNOS病毒能在血管内皮细胞内合成大量的eNOS;(3)Ad一eNOS组NO生成量，在第1天已较两个对照组显著升高(F=79.39，夕<0.05)，第3一5天达对照组50倍以上。 结论(l)腺病毒对血管内皮细胞有较高亲和性，可高效介导人类eNOS基因的表达;(2)重组腺病毒AdCMVceNOS体外转染培养的血管内皮细胞，转基因表达发生于24hr内，并于第3一5天达高峰;(3)转基因产物eNOS的生成，可使内源性NO的产量较对照组升高50-60倍。实验二腺病毒介导LacZ基因在大鼠在体呼吸道上皮的表达 目的经气道转染不同剂量重组腺病毒载体AdcMvLacZ，探讨腺病毒介导的外源基因在大鼠呼吸道上皮转基因表达的分布、时效性、量效关系、毒副作用及其在肺内表达的适宜剂量，为基因治疗PAH提供实验依据。 方法Wistar大鼠70只，随机分成Ad一LacZ组和Ad一eNOS组(每组35只)，分别应用l.67xlogPFu/m 1 AdeMvLacz和^deMve喇05各600林l经气管导管注入大鼠肺脏。于第2、5、7、14、21、28和35天行肺组织x一gal染色。另取wistar大鼠20只随机分成四组(每组5只)，应用高(H组，sxl09PFu/mD、中(M组，l.67xlogPFu/ml)、低(L组，一67xlo8PFu/ml)三种滴度的复制缺陷型重组腺病毒AdCMvLacZ或病毒保存液(C组)各600闪，经气管导管分别注入大鼠肺脏。7天后行肺组织x一gal染色和组织病理学检测，光镜下计算转基因阳性细胞率。 结果(l)经气管注入病毒后2天，Ad一LacZ组大鼠肺组织内即出现转基因表达，7天后达到高峰，第4周开始下降并可维持第四军医大学硕士学位论文至第5周;(2)转基因分布主要位于气管、支气管上皮细胞，肺泡细胞;(3)H、M、L三组大鼠肺组织均出现转基因阳性表达，且H组、M组的阳性细胞率(分别为67.8%士13.5%和63.8%士12.6%)明显高于L组(5.86%士1.680，0)和C组(0.45%士0.060/0)，夕<0.01，而H与M以及L与C组间无统计学差异(p>.05);(4)HE染色显示，仅H组中3只大鼠肺组织有轻度炎性浸润，余三组均未发现炎性反应;(5)所有动物均未发现远隔器官转基因表达。 结论(l)重组腺病毒对呼吸道亲和力较高，经气管导管应用后靶向性强，转基因表达主要分布于气管、支气管上皮以及肺泡细胞。无肝、脾、肾脏等远隔器官表达;(2)经气管导管应用重组腺病毒后，转基因表达时间快(2天)，持续时间长(5周);(3)在一定剂量范围内基因表达