论文部分内容阅读
目的： Nell-1(Nel-like molecule-1)是近年发现的一种分泌型蛋白，它在成骨细胞的分化、骨形成和骨再生等生物学过程中发挥重要作用。本课题组前期研究发现Nell-1在小鼠磨牙牙胚发育过程中呈时空特异性表达，在牙胚发育的成牙本质细胞分化过程中呈强阳性表达。初步推测Nell-1可能在牙胚发育、成牙本质细胞分化过程中发挥作用。目前为止，Nell-1在成牙本质细胞的分化及牙本质形成过程中发挥的作用尚不明确，本实验拟通过体外试验研究人重组Nell-1对人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化的影响，以揭示Nell-1在牙髓细胞成牙本质细胞样细胞分化过程中发挥的作用。 材料和方法： 1、应用改良酶消化法培养人牙髓细胞。 2、使用不同浓度的Nell-1蛋白(0、50 ng/ml、100 ng/ml、150ng/ml)作用于矿化诱导阶段的人牙髓细胞，矿化第3d收集细胞蛋白并测定不同浓度Nell-1蛋白处理后人牙髓细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。然后选取最佳显效浓度的Nell-1蛋白处理牙髓细胞，培养3d、5d、7d，检测Nell-1蛋白处理后的人牙髓细胞在不同矿化时间点的ALP活性。 3、使用最佳显效浓度的Nell-1蛋白作用于人牙髓细胞，矿化0、6h、12h、24h，提取人牙髓细胞的总RNA和总蛋白。应用Real-time PCR检测与成牙本质细胞分化的相关基因骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、牙本质基质蛋白-1(dentine matrix protein-1， DMP-1)、骨钙素(osteocalcin，OCN)和核心结合蛋白因子1(runt-related transcription factor1，Runx2)在不同矿化诱导时间点的mRNA水平表达差异性，应用Western blot技术检测OPN和DMP-1在蛋白水平的表达差异性。 结果： 1、用改良酶消化法成功培养人牙髓细胞，将状态良好的第3代细胞用于后续试验。 2、使用浓度为0（空白对照）、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的Nell-1蛋白矿化诱导人牙髓细胞3d，发现50ng/ml Nell-1蛋白处理组与空白对照组的ALP活性没有明显差异;100ng/ml、150ng/ml Nell-1蛋白处理组与空白对照组相比，ALP活性明显升高(p＜0.05)，且100ng/ml、150ng/ml Nell-1蛋白处理组的ALP活性呈现浓度依赖性增高。选取Nell-1蛋白的最佳起效浓度100ng/ml，分别矿化诱导人牙髓细胞3d、5d、7d，发现随着矿化时间的延长，ALP活性逐渐增高;且相同矿化时间点上Nell-1蛋白处理组与空白对照组相比，ALP活性显著增高(p＜0.05)。 3、用100ng/ml的Nell-1蛋白处理人牙髓细胞，Real-time PCR结果显示在同一诱导时间点上，OPN、DMP-1的mRNA相对表达量均比空白对照组增高，矿化诱导12h、24h时，OPN、DMP-1 mRNA相对表达量与对照组相比显著增高，而OCN、Runx2在各时间点的mRNA相对表达量无明显差异(p＞0.05)。在蛋白表达水平上，刺激后6h时，对照组与实验组的OPN和DMP-1表达量无明显差异;在12h时，实验组OPN和DMP-1明显高于对照组;在刺激24h时，两组蛋白表达量差异更加明显(p＜0.05)。 结论： 1、经改良酶消化法体外培养的牙髓细胞细胞形态较一致，原代细胞形态较复杂，传代至第三代，细胞形态均一，多呈细长梭形，细胞排列较有序，多成涡旋状。 2、随着矿化时间延长，牙髓细胞ALP活性升高。牙髓细胞ALP活性随Nell-1蛋白浓度增大逐渐升高。 3、Nell-1蛋白处理人牙髓细胞后，OPN、DMP-1表达量明显升高，说明Nell-1蛋白可能在促进人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中发挥重要作用。