第一部分 MyD88在难治性癫痫患者及癫痫动物中的表达目的：越来越多的证据表明脑内的炎症反应是癫痫发生发展的重要病理生理机制。髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88, MyD88)是细胞内的接头分子,在机体免疫和炎症反应中起关键作用。本实验首先在难治性颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)患者及急、慢性癫痫动物模型中测定MyD88的表达规律,以探讨癫痫活动是否影响MyD88的表达。方法：1.从本课题组建立的癫痫脑库中随机抽取25例难治性TLE患者和15例对照组患者的颞叶新皮质；使用免疫荧光、免疫组化、和免疫印迹法测定MyD88的表达规律。2.使用氯化锂和皮罗卡品(25mg/kg)在SD大鼠中诱导急性癫痫发作模型,在癫痫发作后6h、24h、和72h,采用免疫荧光和免疫印迹法测定大鼠海马及周围皮质中MyD88的表达规律；建立急性戊四氮(pentylenetetrazol, PTZ)模型(65mg/kg),在PTZ注射后3h、6h、和24h,采用免疫印迹法测定大鼠海马中MyD88的表达规律。3.使用氯化锂和皮罗卡品在SD大鼠中建立慢性TLE模型,在皮罗卡品注射2个月后,采用免疫组化和免疫印迹法在有慢性自发性癫痫发作(spontaneous recurrent seizures, SRS)大鼠的海马及周围皮质中检测MyD88的表达规律；建立慢性PTZ点燃模型,采用免疫印迹法在点燃大鼠脑组织中测定MyD88的表达规律。结果：1.MyD88在难治性TLE患者脑组织中表达升高,主要表达于神经元的胞浆中。2.在急性皮罗卡品模型中,MyD88在癫痫发作后24h和72h表达升高,主要与神经元共表达,没有与胶质细胞共表达；在急性PTZ模型中,MyD88在癫痫发作后6h和24h表达升高。3.在慢性匹罗卡品模型中,在有SRS的大鼠海马和皮质中MyD88表达升高；在慢性PTZ点燃模型中,MyD88在点燃大鼠海马中表达也升高。结论：MyD88在难治性TLE患者和急、慢性癫痫大鼠脑组织中表达均升高,说明癫痫活动可影响MyD88的表达。第二部分MyD88在癫痫大鼠发作中的作用目的：为了测定MyD88对癫痫发作的影响,本部分在急性匹罗卡品和急性PTZ模型中测定MyD88的小分子抑制剂ST2825及刺激分子IL-1p对癫痫发作的影响。方法：1.在急性皮罗卡品模型中,在皮罗卡品注射前20min侧脑室注射不同剂量的MyD88抑制剂ST2825 (2.5μg、5μg、10μg),在皮罗卡品注射后90min,观察ST2825对癫痫发作的行为学影响,评价指标为SE发生率、SE潜伏期、癫痫发作严重程度、和累积发作评分。2.在急性皮罗卡品模型中,在皮罗卡品注射前20min给予10ggST2825,观察其对脑电图(electroencephalogram, EEG)上癫痫发作的影响,评价指标为EEG上第一次癫痫发作潜伏期、总的癫痫发作次数、和总的癫痫发作时间；检测10μg ST2825对小胶质细胞活化的影响。3.在急性PTZ模型中,在PTZ(65mg/kg)注射前20min给予10μgST2825,观察其对癫痫发作的影响,评价指标为第一次阵挛发作的潜伏期、全身强直-阵挛发作的潜伏期、和全身强直-阵挛发作的持续时间。4.在急性皮罗卡品模型中,在皮罗卡品注射前20min给予ST2825,前10min给予重组大鼠IL-1β,实验分为溶剂组、IL-1β组,ST+IL-1β组,观察IL-1β是否有促惊厥作用,及ST2825对IL-1β促惊厥作用的影响。5.在急性PTZ模型中,在PTZ注射前20min给予ST2825,前10min给予重组大鼠IL-1β,实验分为溶剂组、IL-1β组,ST+IL-1β组,观察IL-1β是否有促惊厥作用,及ST2825对IL-1β促惊厥作用的影响。结果：1.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射5μg及10μg ST2825显著延长SE潜伏期,减弱癫痫发作的严重程度,降低累积发作评分。2.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射10μg ST2825显著延长EEG上第一次癫痫发作的潜伏期,减少癫痫发作的总次数,缩短癫痫发作总的持续时间；此外,10μg ST2825显著减轻由癫痫发作诱导的小胶质细胞活化程度。3.在急性PTZ模型中,侧脑室注射10μg ST2825显著延长第一次阵挛发作的潜伏期、延长全身强直-阵挛发作的潜伏期、并缩短全身强直-阵挛发作的持续时间。4.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射lng IL-1β显著缩短SE潜伏期,加重癫痫发作严重程度,增加累积发作评分；在IL-1β前10min给予ST2825, ST2825阻止IL-1β诱导的SE潜伏期缩短,减轻IL-1β诱导的癫痫发作程度加剧,减弱IL-1β诱导的累积发作评分增加。此外侧脑室注射lng IL-1β显著缩短EEG上第一次癫痫发作的潜伏期,增加总的癫痫发作时间；ST2825阻止IL-1β诱导的EEG上第一次发作潜伏期的缩短,减轻总的癫痫发作次数,减少IL-1β诱导的癫痫发作时间的增加。5.在急性PTZ大鼠模型中,i.c.v. lng IL-1β显著缩短全身强直-阵挛发作的潜伏期并延长全身强直-阵挛发作的持续时间。预先给予ST2825可阻断IL-1β诱导的潜伏期缩短及全身强直-阵挛发作持续时间的增加。结论：1.MyD88的小分子抑制剂ST2825在急性匹罗卡品模型中可减少行为学上及EEG上的癫痫发作,减轻小胶质细胞的活化；ST2825在急性PTZ模型中也能减少癫痫发作。2.IL-1β在急性皮罗卡品和急性PTZ模型中均具有促惊厥作用,ST2825能抑制IL-1β的促惊厥作用。第三部分MyD88参与癫痫发作的机制探讨目的：NR2B酪氨酸位点的磷酸化在NMDA受体功能和神经元兴奋性中发挥重要作用。上部分的研究说明MyD88在癫痫活动中起重要作用,本部分对NR2B酪氨酸的磷酸化水平改变是否参与这个过程进行探讨。方法：1.采用免疫印迹法检钡NMD A亚基NR2B酪氨酸磷酸化位点1472(NR2B Tyr1472)在不同干预条件下的磷酸化水平改变,分组：vehicle组、Pilo组、IL-1β组、IL-1β+Pilo组、ST+IL-1β+Pilo组、和ST+Pilo组。2.在急性皮罗卡品模型中,在匹罗卡品注射前20min给予NR2BTyr1472的抑制剂艾芬地尔,在皮罗卡品10min前给予重组大鼠IL-1β,实验分为vehicle组、IL-1β组、Ifen组、和Ifen+IL-1β组,观察抑制NR2B Tyr1472后对IL-1β促惊厥作用的影响。3.在急性PTZ模型中,在PTZ注射前20min给予艾芬地尔,在PTZ 10min前给予重组大鼠IL-1β,实验分为vehicle组、IL-1β组、Ifen组、和Ifen+IL-1β组,观察抑制NR2B Tyr1472后对IL-1β促惊厥作用的影响。结果：1.单独给予IL-1β或癫痫发作本身(仅皮罗卡品)增加NR2B Tyr1472位点的磷酸化,分别增加154%和134%(P<0.05)。同时给予IL-1β和皮罗卡品时,与vehicle组相比,NR2B Tyr1472的磷酸化水平增加213%,说明IL-1β和癫痫发作对其磷酸化水平增加具有叠加效应。10μgST2825显著抑制由癫痫发作引起的NR2B Tyr1472磷酸化水平增高(P<0.05)。此外,10μg ST2825有效阻止IL-1β+皮罗卡品诱导的NR2BTyr1472磷酸化水平增高(P<0.01)。2.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射lng IL-1β显著缩短SE潜伏期,加重癫痫发作严重程度,增加累积发作评分；在IL-1β前10min给予NR2B Tyr1472的抑制剂艾芬地尔,艾芬地尔阻止IL-1β诱导的SE潜伏期缩短,缓和IL-1β诱导的癫痫发作程度加剧,减弱IL-1p诱导的累积发作评分增加。3.在急性PTZ模型中,与vehicle组相比,IL-1β组显著缩短全身强直-阵挛发作的潜伏期并延长全身强直-阵挛的持续时间。相反,与vehicle组相比,艾芬地尔显著增加第一次阵挛发作和强直-阵挛发作的潜伏期,减少全身强直-阵挛的持续时间,具有抗惊厥作用。此外,艾芬地尔可阻断IL-1β诱导的潜伏期缩短和全身强直-阵挛发作持续时间的延长。结论：1.在癫痫发作中,NR2B Tyr1472的磷酸化水平增高,IL-1β可使NR2B Tyr1472的磷酸化水平进一步增高,ST2825可降低由癫痫发作诱导的NR2B Tyr1472磷酸化水平的增加。2.NR2B亚基的选择性抑制剂艾芬地尔可抑制癫痫发作活动,并可抑制IL-1β的促惊厥作用。第四部分MyD88对癫痫形成的影响目的：越来越多的证据表明脑内的炎症反应在癫痫形成中起重要作用,抗炎治疗有可能成为抗癫痫形成治疗的新策略。前部分的研究证实MyD88在癫痫发作中起重要作用,本部分进一步研究MyD88对癫痫形成的影响。方法：1.在SD大鼠中每天给予亚惊厥剂量的PTZ (33mg/kg)建立慢性PTZ点燃模型,IL-1β在PTZ前10min给予,ST2825在PTZ前20min给予,分Con组、vehicle组、IL-1β组、和ST2825组,记录每次PTZ注射后癫痫发作的最高级别和达到完全点燃的潜伏期,完全点燃是指大鼠在PTZ注射后连续3天达到4级或4级以上的癫痫发作。2.在慢性皮罗卡品模型中,在SE结束后24h,每天侧脑室注射IL-1β和ST2825,每天一次,连续给予7天。实验分为vehicle组、IL-1β组、和ST2825组。从SE后的第21-34天,使用高清视频系统监测SRS活动。分析指标为SRS发生率、SRS发作次数、和SRS发作严重程度。结果：1.在慢性PTZ点燃模型中,IL-1β组完全点燃的潜伏期与vehicle组相比明显缩短,IL-1β组的癫痫发作级别在第5、7-9、10、12天与vehicle组相比明显加重。相反,ST2825组完全点燃的潜伏期与vehicle组相比明显延长,ST2825组的癫痫发作级别在第6-8、13-18天明显减轻。此外,Con组与vehicle组相比,达到完全点燃的潜伏期及癫痫发作严重程度没有明显差别。2.在慢性皮罗卡品模型中,SRS发生率在vehicle组、IL-1β组、和ST2825组没有明显差异。与vehicle组相比,IL-1β组SRS每天发作次数明显增加,差异有统计学意义(p<0.05),ST2825组SRS每天发作次数差别不显著(p>0.05)。与vehicle组相比,SRS的严重程度在IL-1β组明显增加(p<0.05),而在ST2825组差别不显著(p>0.05)。结论：1.在慢性PTZ点燃模型中,IL-1β可缩短PTZ完全点燃的潜伏期,并缩短点燃过程。相反,ST2825可显著延长完全点燃的潜伏期并延缓点燃过程,具有一定的抗癫痫形成作用。2.在慢性皮罗卡品模型中,IL-1β可增加SRS发作频率并加重SRS发作严重程度,而ST2825对SRS发作频率及SRS发作严重程度没有影响,说明post-SE诱导的癫痫形成过程更难被修饰,多阶段或多药联合干预可能是未来的研究方向。