目的通过构建在Ⅰ型干扰素反应性细胞特异性敲除NEDD8的小鼠模型,探讨了类泛素化修饰对造血干细胞的影响以及其影响机制,旨在为调节该通路相关药物研究提供理论依据。方法首先我们用免疫荧光组化方法确认了NEDD8的定位。接着构建了在Ⅰ型干扰素反应性细胞特异性敲除NEDD8的小鼠模型并用凝胶电泳和Western Blot方法确认了基因敲除小鼠模型的构建情况,统计了NEDD8缺失和对照小鼠的死亡率,运用HE染色观察NEDD8缺失和对照小鼠的骨髓腔病理,利用表面标记分子染色和流式细胞术分析了NEDD8缺失和对照小鼠的造血干细胞的绝对数,利用AnnexinV染色和BrdU掺入的方法分析了NEDD8缺失和对照小鼠造血干细胞的凋亡和增殖情况。为了排除对照和NEDD8基因缺失小鼠内环境因素的影响,我们检测了嵌合体小鼠中NEDD8缺失小鼠和对照小鼠来源的造血干细胞、淋系造血前体细胞、髓系造血前体细胞、粒-巨噬系造血前体细胞和巨核/红系造血前体细胞以及造血干细胞的凋亡和增殖情况。我们利用磁珠分离技术、Western blot分离了NEDD8缺失小鼠和对照小鼠的Lin阴性细胞,检测了C-myc、N-myc和Cullin1的蛋白量。为了进一步验证该猜想我们又给NEDD8缺失小鼠腹腔注射myc抑制剂。此外,我们还检测了腹腔注射MLN小鼠Lin阴性细胞的Cullin4A的蛋白量。结果1.NEDD8缺失对小鼠造血的影响 本研究采用Western blot、表面标志分子染色、Brdu染色、流式细胞术等方法研究了Ⅰ型干扰素反应性细胞特异性敲除NEDD8基因对小鼠造血的影响。结果显示:NEDD8与CD117在骨髓腔中存在共定位。Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠在基因和蛋白质水平上已经敲除。Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠存活率低于Nedd8^F/F小鼠。Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠骨髓腔细胞数低于Nedd8^F/F小鼠。Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠的骨髓白细胞、LSK和造血干细胞的绝对数低于Nedd8^F/F小鼠。在嵌合体小鼠中,来源于Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠的LSK、造血干细胞的绝对数低于Nedd8^F/F小鼠并且来源于Nedd8^F/F,Mx1-cre的淋系造血前体细胞、髓系造血前体细胞和巨核/红系造血前体细胞比例均低于Nedd8^F/F小鼠。但是,Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠的粒系-巨噬系前体细胞比例高于Nedd8^F/F小鼠。嵌合体小鼠骨髓、脾脏和外周血中的来源于Nedd8^F/F,Mx1-cre的髓系细胞比例均低于Nedd8^F/F小鼠,而嵌合体小鼠脾脏和外周血中的来源于Nedd8^F/F,Mx1-cre的B淋巴细胞比例均低于Nedd8^F/F小鼠,骨髓中B淋巴细胞无显著性差异。在嵌合体小鼠骨髓和外周血中,Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠的T淋巴细胞比例高于Nedd8^F/F小鼠,但在脾脏中无显著性差异。Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠造血干细胞的凋亡和增殖明显高于Nedd8^F/F小鼠。在嵌合体小鼠中,Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠造血干细胞的凋亡和增殖也明显高于Nedd8^F/F小鼠。结果提示,NEDD8缺失降低了小鼠的生存率,使骨髓腔细胞减少,使得造血干细胞、淋系造血前体细胞、髓系造血前体细胞、巨核/红系造血前体细胞以及髓系细胞的数量减少,同时还致使造血干细胞的凋亡和增殖增多。2.NEDD8缺失引起造血耗竭的可能机制探讨 本课题利用磁珠分离、Western blot以及流式细胞术初步探讨了NEDD8缺失引起造血耗竭的可能机制。结果显示NEDD8缺失抑制了Cullin1的泛素化修饰过程从而造成C-myc、N-myc蛋白的堆积。腹腔注射myc抑制剂的NEDD8敲除小鼠的造血干细胞绝对数有所逆转。Nedd8^F/F小鼠的Lin阴性细胞和腹腔注射DMSO的小鼠的Lin阴性细胞的NEDD8-Cul4A蛋白量显著多于Cul4A蛋白量,Nedd8^F/F,Mx1-cre小鼠的Lin阴性细胞的Cul4A的蛋白量显著高于Nedd8^F/F小鼠Lin阴性细胞。腹腔注射DMSO的Lin阴性细胞的NEDD8-Cul4A蛋白量略高于腹腔注射MLN4924的Lin阴性细胞。提示我们,NEDD8的缺失抑制了Cullin1的泛素化修饰过程,从而影响了Fbw7对C-myc和N-myc的泛素化修饰,从而造成小鼠造血衰竭。结论Neddylation可影响造血干细胞的分化、增殖和凋亡。其机制为:NEDD8的缺失抑制了Cullin1的类泛素化修饰过程,从而影响了Fbw7对C-myc和N-myc的泛素化修饰,最终造成小鼠造血衰竭。