缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧反应的关键的转录调节因子，在许多器官的O₂平衡中起着十分重要的作用。HIF-1的靶基因在血管生成、能量代谢、红细胞生成、血管舒缩功能和凋亡／增殖反应以及正常发育和肿瘤生长中起到了至关重要的作用。因此，对细胞、组织或动物体内的HIF-1活性进行精确的调控，对药物的开发和生物学研究是至关重要的。由于大分子的蛋白质是很难通过细胞膜的，因此我们通过本研究寻找一种可以调节HIF-1生物学活性的短肽，为缺血性疾病及肿瘤的治疗的新途径进行了探索性的研究。我们的工作分为以下三部分进行： 一．HIF-1相关肽的筛选： 以抗HIF-1α单克隆抗体（HIF-1α mAb）为配基，采用亲和免疫法从噬菌体随机12肽库中筛选与抗体特异结合的噬菌体。在筛选过程中，逐轮提高HIF-1α mAb的稀释度并增强洗脱强度。3轮筛选后，我们首先随机挑取10个克隆，提取单链DNA后测序，获得了7个序列。随后又挑取了45个克隆，经过Dot-ELISA鉴定后，对其中的22个阳性克隆测序，得到6个序列。两次测序共获得11个序列，其中重复最多的序列是G P H H Y W Y H L R L P。 二．HIF-1相关肽序列的分析设计及合成： 首先将筛选出的序列与HIF-1α进行同源性比对，结果发现这些序列与HIF-1α虽然不具有同源性，但丰度较高的氨基酸却非常相似，这说明我们筛选得到的表位是HIF-1α的有效表位。由于HIF-1α的降解途径主要是由于pVHL对其ODD区的识别所 南京医科大学硕士学位论文导致的，并且在0＊D区中与w＊L作用的序列是高度保守的，所以我们据此确定了拟合成的 ＊F刁 相关肽的核。C序列为LAPYI。这一核。C序列的理化性质并不适合于体外的细胞实验，因此我们应用蛋白质分析软件，在核。。序列的基础上，以等电点、分子量、极性等理化性质为指标，用第一步实验得到的12肽序列分析设计了一系列全新的与＊F刁相关的序列。符合实验要求的候选序列有 8个，根据等屯互最接近细胞培养液的 pH值，体外半衰期最长，不稳定系数和分子量最小的原则，最终确定合成肽的序列为＊＊AP’＊1＊＊HH，其中P＊为羟脯氨酸。三．HIF刁相关肽的活性及作用机制的研究： 用传代培养的 PC12细胞，给予终浓度为 125 U mol／L CoCI。模拟缺氧sh，同时加入不同浓度的合成肽，观察合成肽对细胞损伤指标寻酸脱氢酶（lactate dehydrogenase。LDH）、超氧化物歧化酶（superoxlde dlsmutase，SOD）和丙＝醛（malondialdehyde，MDA）的影响。结果发现，合成肽N．2、2刀、20刀 P mol／L组)与对照组相比，S OD活力明显增强，且呈浓度依赖性。MDA的含量则呈下降趋势。合成肽对LDH的漏出量没有明显的影响。 鉴于上述实验结果，采用免疫荧光技术，我们进一步研究了在常氧和化学缺氧（用终浓度为125以2OI几 COQZ模拟缺氧4m条件下，合成肽对PC12细胞的＊Fl及其下游靶基因VEGF蛋白水平的影响。结果发现，无论是在常氧还是在化学缺氧条件下，合成肽0．2、ZO刀vmol几组）与对照组相比较，m卜1和＊＊＊F的蛋白水平没有明显的差异。以上的结果说明我们设计合成的HIF刁 相关肽具有一定的生物学活性，但较弱，尚不能达到调节HIFl蛋白水平从而完全保护细胞免受缺氧的损伤。