原发性肝癌是恶性度高,预后差的恶性肿瘤,被称为“癌中之王”,随着美国[1]及我国[2]肝癌发病率的增加,肝癌已跃居世界癌症死因第四位[3]。全球范围内,原发性肝癌占所有癌的5.4%[4],每年约有610,000人死于肝癌[3]。由于其恶性度高、进展快、容易复发,将近80%的患者在诊断后一年内死亡[5]。肝细胞癌总体疗效不理想,部分原因是由于肿瘤细胞对放、化疗的抵抗[6]。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论的提出为抗肿瘤治疗提供了新的思路,肿瘤细胞群体中绝大多数肿瘤细胞是已经分化成熟了、没有增殖能力的细胞,常规的放、化疗只是杀灭了这部分细胞,而具有增殖和成瘤能力的肿瘤干细胞存活了下来。这部分细胞则成为肿瘤复发、治疗抵抗的根源[10]。因此,探索肿瘤干细胞在肿瘤发生发展过程中的作用,开发靶向肿瘤干细胞的治疗手段,通过不同手段杀灭或者抑制肿瘤干细胞,有望成为肿瘤治疗中新的研究领域。有报道指出,肝癌细胞株中存在功能性的肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)。有效地清除肝癌干细胞对于获得理想的抗肝癌疗效是十分必要的。人类CD133基因在多种肿瘤干细胞中表达,是多种肿瘤干细胞(包括LCSCs)的新型标志物。分子靶向治疗可以有针对性地作用于有特异性分子标记的细胞群体。肿瘤干细胞作为肿瘤内部一个亚群细胞是否可选择分子靶向治疗作为一种针对性的治疗手段?已有一些研究针对肿瘤干细胞和非成瘤细胞群体基因表达差异性进行基因靶向治疗的探索。从基因水平调控细胞的基因表达过程理应成为治疗肿瘤的理想手段。腺病毒是目前在肿瘤基因治疗中应用相当广泛的载体之一,增强其对外源基因的转导和转录靶向性,可以大大提高治疗效果。利用肿瘤特异性启动子(Tumor specific promoter, TSP)在转录水平对外源基因的调控实现其在肿瘤细胞中的特异表达。因此,从某种程度上说,启动子的转录靶向性评价在肿瘤的基因治疗中不仅具有重要价值,而且也是决定其能否最终走向临床试验的必要研究。Survivin是一种细胞凋亡抑制因子,组织分布特征具有明显的细胞选择性,仅在胚胎细胞和多种肿瘤细胞中表达,而在成人正常组织中基本不表达。黄爱龙等[7]证实在肝癌的靶向性基因治疗中,Survivin启动子具有较强的转录活性。Jin XD等[8]研究证实HepG2肝癌细胞中,Survivin的表达在低剂量率照射的条件下随着剂量的增加而增高。Nandi S等[9]表明,在脑胶质瘤细胞U118MG中,2Gy剂量照射后survivin的mRNA水平比照射前上调了10倍。本研究探讨Survivin作为一种有效的放射诱导的肿瘤特异性启动子在肝癌干细胞中的转录活性。目的通过MACS分选技术分离肝癌干细胞,探讨其生物学特性。构建Survivin启动子调控的重组腺病毒载体,判定其在肝癌干细胞中的启动子活性,观察其是否具有辐射诱导性,确定其在肝癌干细胞中的靶向性,从而为肝癌干细胞的临床靶向治疗提供实验依据。方法1、以肝癌HepG2为研究对象,通过MACS分选技术分离纯化肝癌干细胞。并通过流式细胞术检测分选前后CD133的表达率变化。2、无血清培养技术富集肝癌干细胞,并通过血清诱导肝癌干细胞的分化。3、通过流式细胞术,分析低剂量辐射后肝癌细胞中肝癌干细胞百分比的变化。4、体外克隆形成实验、增殖实验和体内成瘤实验分别判定肿瘤干细胞的生物学特性。5、RT-PCR方法分别检测辐射对Survivin mRNA表达水平的影响。6、构建Survivin启动子介导的含萤光素酶报告基因的pGL3B载体,通过萤光素酶报告基因检测试剂盒,体外分析初步判定其在肝癌干细胞中的转录活性。7、低剂量辐射对Survivin启动子活性的影响。8、利用基因重组技术构建Survivin启动子介导的含萤光素酶报告基因的腺病毒载体,通过萤光素酶报告基因检测试剂盒,体外分析判定其在肝癌干细胞中的转录靶向性。9、观察低剂量辐射对重组腺病毒的诱导作用。结果1、分选前,流式细胞术测试CD133~+细胞的百分比为1.54±0.26%,分选后,CD133~+细胞的百分率为89.58±0.72%,统计学分析表明分选前后有显著差异(p<0.05)。免疫磁珠分选技术是纯化HepG2细胞系中的CD133~+细胞的理想方法之一,分选纯度高,且不影响细胞的活性。2、CD133~+肝癌细胞分选后,能在含有生长因子的无血清培养条件下逐渐形成细胞球,且随着时间的延长,细胞球日益增多且致密。用含血清的培养液诱导,24小时即贴壁分化。3、未照射组,CD133~+细胞的百分比为1.24±0.36%,低剂量(2Gy)照射肝癌HepG2细胞后,所得细胞中CD133~+细胞的百分比为3.91±0.21%,p<0.05,两者具有明显的统计学差异,提示低剂量(2Gy)照射可能使CD133~+细胞增多。4、与CD133-肿瘤细胞相比,CD133~+肿瘤细胞在体外有较强的克隆形成能力和增殖能力,在NOD/SCID小鼠体内中有较强的成瘤能力。5、辐射诱导HepG2细胞Survivin mRNA表达。6、成功构建了真核表达质粒pGL3B-SUR-PRO,质粒转染肝癌干细胞,通过萤光素酶活性分析,结果表明其在肝癌干细胞中具有转录活性。7、低剂量辐射(2Gy)处理后,增加了质粒在肝癌干细胞中的转录活性。8、成功构建了重组腺病毒pAd-Sur-luc,感染肝癌干细胞,通过萤光素酶活性分析,表明与肝癌细胞相比,重组腺病毒在肝癌干细胞中的转录活性更强。9、与未照射组相比,低剂量辐射具有诱导重组腺病毒在肝癌干细胞转录活性的作用。结论免疫磁珠分选技术是纯化HepG2细胞系中的CD133~+细胞的理想方法之一,分选纯度高,且不影响细胞的活性。分选的肝癌干细胞能在无血清培养基中成球生长,在有血清培养基中能贴壁分化。Survivin启动子介导的重组腺病毒在肝癌细胞及肝癌干细胞中均具有较强的转录活性,并且,低剂量辐射能够诱导重组腺病毒对肝癌干细胞的靶向杀伤作用。目的和意义:通过复习文献,对TACE联合HIFU与单纯TACE治疗中晚期肝癌的疗效进行循证医学研究,综合分析得到一个对疗效较为普遍性的结论,用于指导临床。材料和方法:检索国内外有关数据库,查找符合纳入标准的临床对照试验(截至到2010年6月)。采用Meta分析方法,对国内外公开发表的有关TACE联合HIFU与单纯TACE治疗中晚期肝癌疗效的临床随机对照试验观察随访研究文献进行综合分析,对纳入文献进行质量评价。根据获得的文献数据,分别对两种疗法引起的总有效率及临床受益率及患者的0.5, 1, 2, 3年生存情况进行分析。应用Stata10.0软件中统计分析相应的研究指标。当各项研究间存在异质性时,用固定效应模型表达,反之用随机效应模型表示。如试验结果存在异质性,进行敏感性分析及亚组分析。结果:9项独立的临床随机对照试验研究共计736例病例进入了本次meta分析,与单纯TACE组相比,TACE联合HIFU治疗组能明显提高总有效率CR+PR (OR=2.43; 95% CI 1.55–3.82; p=0.000)和临床受益率CR+PR+SD (OR=2.75; 95% CI 1.83–4.13; p=0.000),同时改善患者的0.5年生存率(OR=5.95; 95% CI 3.43-1033; P=0.000), 1年生存率(OR=3.25; 95% CI 2.31-4.59; P=0.000), 2年生存率(OR=3.34; 95% CI 1.93-5.76; P=0.000)和3年生存率(OR=2.97; 95% CI 1.77-4.98; P=0.000)。敏感性分析证实这些结果可信且不受发表偏倚的影响。结论:TACE联合HIFU治疗肝癌的近、远期疗效优于单纯TACE治疗。由于结果基本来自单个研究,纳入研究质量不高,因此使用这些结论必须谨慎,该结果不能作为推荐临床应用的证据。