维甲酸诱导基因I（Retinoic acid inducible gene-I,Rig-I）是重要的细胞内模式识别受体,在炎症反应中发挥着重要功能。细胞损伤,如缺血缺氧、创伤性损伤、毒素和辐射作用是公认的模式识别受体的触发因素。模式识别受体参与炎症反应和炎症应激。最新的研究表明,Rig-I通过多种途径介导炎症反应。先天的免疫系统是炎症反应的关键要素。干扰素β启动子刺激因子1（IPS-1）是一种Rig-I介导的关键下游信号,对先天免疫应答至关重要。IPS-1包含多种与肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）相互作用的组分。TRAF6被认为在炎性因子的表达中起着至关重要的作用。TRAF6信号激活募集IKK复合物,导致核转录因子κB（NF-κB）激活。此外,Rig-I与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）相互作用形成炎症小体,从而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1）,促进炎性因子IL-1β、IL-8的释放。它们协调感染后先天免疫反应和调节IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的表达。细胞内模式识别受体参与了多种与神经炎症相关疾病的发病过程。星形胶质细胞作为最大的胶质细胞,在神经炎症反应中发挥重要作用。除了病毒和其它病原体的感染外,缺氧相关刺激也可激活神经系统非感染性炎症反应。Rig-I与病毒感染引起的脑内星形胶质细胞炎症应激密切相关,可能参与神经胶质细胞对各种刺激的反应,调控潜在的神经元损伤,而它对缺氧诱导的神经胶质炎症调节作用并不清楚。为了探讨Rig-I调控化学缺氧诱导神经胶质的炎症机制,我们建立了体外星形胶质细胞化学缺氧模型。目的:1.明确Rig-I是否参与化学缺氧诱导的神经胶质炎症;评价NF-κB在Rig-I诱导的神经胶质炎症中的作用。2.研究IPS-1/TRAF6在化学缺氧诱导神经胶质炎症中的作用;探讨Rig-I调控化学缺氧诱导神经胶质炎症的信号通路。3.探讨Rig-I调节化学缺氧诱导的神经胶质细胞内caspase-1激活的机制及胶质细胞水肿相关胞内渗透压变化。方法:采用CoCl₂刺激人源星形胶质瘤细胞系U87细胞,建立体外星形胶质细胞化学缺氧模型。应用实时定量RT-PCR检测相关蛋白的mRNA水平,采用Western Blot检测相关蛋白水平,使用亚细胞离心分离技术检测NF-κB的核转位变化。1.分析在化学缺氧后不同时间点（0、1、3、6、12和24小时）U87细胞中Rig-I的mRNA水平和Rig-I的蛋白表达变化;采用免疫荧光染色观察Rig-I蛋白定位。采用高表达Rig-I的质粒瞬时转染U87细胞,检测Rig-I的m RNA水平和Rig-I的蛋白水平、以及NF-κB的活性和核定位;给予抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）抑制NF-κB活性,检测PDTC对Rig-I诱导的炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA水平的影响。2.首先,检测CoCl₂处理U87细胞后不同时间点（0、3、6、12和24小时）NF-κB/P65的活性变化;在CoCl₂处理前,采用IPS-1的小干扰RNA（IPS-1-siRNA）瞬时转染U87细胞24小时后,给予CoCl₂处理,检测NF-κB的活性变化、IPS-1的mRNA水平和IPS-1的蛋白水平的变化。其次,检测CoCl₂处理U87细胞24小时后IPS-1蛋白水平的变化;在CoCl₂处理前,采用Rig-I的小干扰RNA（Rig-I-siRNA）瞬时转染U87细胞24小时后,给予CoCl₂处理,检测IPS-1蛋白水平及炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA水平变化。最后,研究TRAF6在Rig-I/IPS-1诱导的NF-κB活化和化学缺氧诱导的炎症反应中的作用,采用免疫沉淀技术,检测化学缺氧后IPS-1蛋白和TRAF6蛋白的结合情况。采用TRAF6小干扰RNA（TRAF6-siRNA）瞬时转染U87细胞24小时后,给予CoCl₂处理,检测NF-κB的活性变化。si-TRAF6或对照RNA片段（si-Con）瞬时转染U87细胞24小时后,给予CoCl₂处理,提取细胞总RNA并逆转录成cDNA,检测炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA水平变化。3.应用免疫荧光技术检测caspase-1/P20的细胞分布,以蓝色荧光标记细胞核,绿色荧光反映caspase-1/P20蛋白水平。采用Rig-1-siRNA瞬时转染U87细胞24小时后,给予CoCl₂处理,检测caspase-1/P20蛋白水平变化。CoCl₂刺激U87细胞24小时,同时给予钙通道阻滞剂硝苯地平或顺羧酸铂（Carb）或Na-K-2Cl抑制剂布美他尼或自由基清除剂NAC等处理,检测caspase-1/P20蛋白水平变化。应用冰点渗透压仪检测化学缺氧诱导与水肿发生相关的胞内渗透压数值变化。CoCl₂处理U87细胞,同时给予硝苯地平、Carb、NAC、布美他尼或采用Rig-1-siRNA瞬时转染U87细胞24小时再CoCl₂处理。提取超声破碎细胞和细胞质,检测胞浆渗透压数值变化。结果:1.化学缺氧后6、12和24小时能导致Rig-I的mRNA水平和Rig-I的蛋白表达上调,与对照组（0小时）比较有显著差异（P<0.05）。免疫荧光染色显示Rig-I蛋白在CoCl₂处理后明显增加（P<0.05）。Rig-I在U87细胞过表达后,Rig-I的mRNA水平和Rig-I的蛋白表达上调,而且能诱导NF-κB/P65的Ser536位点磷酸化增加,与对照组（空质粒转染组）比较有显著差异（P<0.05）。但U87细胞总蛋白水平保持不变（P>0.05）。此外,激活Rig-I能导致核内NF-κB蛋白增加和细胞质蛋白减少（P<0.05）。Rig-I激活能诱导细胞炎性因子（IL-1β,IL-6和TNF-α）的mRNA水平升高,与对照组（空质粒转染组）比较有显著差异（P<0.05）。与溶剂组比较,抑制剂PDTC能明显下调Rig-I激活的细胞炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA水平（P<0.05）。2.化学缺氧后3,6,12和24小时的NF-κB/P65在Ser536位点的磷酸化作用快速增加,与对照组（0小时）相比有显著差异（P<0.05）。IPS-1-siRNA转染U87细胞下调其功能,皆能显著降低NF-κB活性、IPS-1的mRNA水平和IPS-1蛋白水平（P<0.05）。化学缺氧后星形胶质细胞IPS-1蛋白水平显着增加,Rig-I-siRNA处理星形胶质细胞能显著逆转IPS-1蛋白水平的增加,与对照组（si-Con）比较有显著性差异（P<0.05）。IPS-1-siRNA瞬时转染U87细胞后,能导致星形胶质细胞炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA水平显著降低（P<0.05）。化学缺氧能诱导TRAF6和IPS-1蛋白相互结合增加,与对照组（si-Con）比较有显著差异（P<0.05）。si-Rig-I处理能导致TRAF6和IPS-1蛋白结合降低（P<0.05）。si-TRAF6处理也能显著下调NF-κB/P65蛋白的Ser536位点磷酸化（P<0.05）和降低炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA水平（P<0.05）。3.免疫荧光技术检测显示:正常组和对照组U87细胞的绿色荧光强度较弱,而CoCl₂处理U87细胞24小时,细胞中绿色荧光强度显著增加,caspase-1/P20蛋白水平显著上升,与对照组比较有显著性差异（P<0.05）。与对照RNA片段组（si-Con）比较,Rig-1-siRNA能显著降低化学缺氧后胞内caspase-1/P20的蛋白水平（P<0.05）。CoCl₂处理U87细胞24小时同时给予硝苯地平或Carb或布美他尼或NAC处理,皆能明显降低胞内caspase-1/P20的蛋白水平,与溶剂组比较有显著性差异（P<0.05）。化学缺氧能诱导胞内渗透压数值显著上调,与溶液对照组相比差异有显著性（P<0.05）。给予钙离子拮抗剂能部分抑制化学缺氧诱导的渗透压增强,与缺氧组比较差异有显著性（P<0.05）。而NAC、Na-K-2Cl抑制剂以及Rig-I功能抑制未引起胞内渗透压明显变化。结论:1.化学缺氧能诱导Rig-I在星形胶质细胞中的基因转录和蛋白翻译上调,其功能增强能导致NF-κB依赖的炎性因子的表达。Rig-I通过NF-κB调控缺氧引起的神经胶质炎症。2.化学缺氧诱导神经胶质炎症的发生与Rig-I功能上调密切相关。Rig-I的激活通过诱导IPS-1和TRAF6的蛋白结合,调控了NF-κB活性及其核转位,继而促进化学缺氧诱导的炎性因子的基因表达。阻断IPS-1/TRAF6通路可下调Rig-I诱导的神经胶质炎症。3.Rig-I也参与了化学缺氧诱导的胶质细胞内caspase-1激活的调节,与钙信号依赖的炎性因子活化有一定联系。但是Rig-I功能上调可能与化学缺氧诱导的胶质细胞水肿无关。以上研究结果表明,Rig-I通过NF-κB和caspase-1信号调控化学缺氧炎性因子的表达和激活,参与IPS-1/TRAF6信号调控,且两者差异性调控了炎症应激反应。因而,Rig-I可能成为临床研发治疗脑缺氧/缺血的潜在药物靶点,为改善中老年人缺血性脑损伤提供新的思路。