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Smad3/microRNA-21介导阿托伐他汀的促血管新生作用背景他汀类药物具有不依赖于降脂作用的多方面心血管保护作用。近来研究发现多种他汀类药物具有促进缺血性血管新生作用,并且揭示这一作用与激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号有关。然而他汀类药物促进血管新生的上游机制目前仍未完全阐明。MicroRNA-21 (miR-21)是一种非编码的小RNA,主要通过转录后抑制靶基因表达调节各种生物功能。近来研究提示miR-21可能具有促进血管新生的作用。已有研究证实10号染色体q23有缺失且与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)为miR-21的靶基因,而PTEN可抑制Akt的激活。因此,miR-21可能通过PTEN/Akt信号途径促进血管新生。临床资料显示他汀药物可以影响内皮祖细胞中microRNA (miRNA)的表达。因此,我们推测他汀类药物的促血管新生作用可能与其影响miR-21水平有关。Smad3是转化生长因子β(TGFβ)/Smads信号途径中受体活化型蛋白之一,参与细胞的增殖及分化等过程。已有研究提示Smad3在促进血管新生中可能起重要作用,而其它研究却发现他汀类药物可影响Smad蛋白的表达。因此我们推测他汀类药物的促血管新生作用可能与其影响Smad3蛋白表达有关。近来研究资料表明Smad3在促进miR-21的生物合成中起重要调控作用。因此,他汀类药物有可能通过促进Smad3蛋白表达,进一步增加miR-21的生物合成而发挥其促血管新生作用。目的观察阿托伐他汀对缺血肌肉组织以及体外培养的人脐静脉内皮细胞中Smad3及miR-21表达的影响以及对血管新生的促进作用；探讨Smad3/miR-21在阿托伐他汀的促进血管新生中的作用。方法1.体内实验：20只后肢缺血ICR小鼠被随机分为两组：对照组及阿托伐他汀处理组(每组10只)。下肢动脉离断术后次日起阿托伐他汀组每日胃饲给予阿托伐他汀5 mg/kg,对照组给予等体积生理盐水溶液,共4周。实验结束后收取缺血后肢肌肉标本,提取组织蛋白行Western Blot法检测Smad3蛋白表达水平；提取RNA行萤光定量Real-time PCR (Q-PCR)法检测缺血组织中miR-21变化以及免疫组化法计数缺血组织中毛细血管数目。2.体外实验：不同浓度的阿托伐他汀(Control,0.0001μM, 0.001μM及0.1μM)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)孵育48小时。Western Blot法检测细胞中Smad3、PTEN及磷酸化的Akt (p-Akt)水平；Q-PCR法检测细胞中miR-21表达；In Vitro Angiogenesis Assay检测管样结构长度。3.MiR-21干扰抑制实验：用脂质体LipofectamineTM 2000将不同浓度的miR-21抑制剂(分别为10nM、30nM、50 nM及100 nM)转染HUVEC,然后与0.1uM的阿托伐他汀共孵育48小时。Western Blot法检测细胞中PTEN及p-Akt的蛋白表达水平；Q-PCR法检测HUVEC中miR-21和PTEN表达情况；In Vitro Angiogenesis Assay检测管样结构长度。4.MiR-21过表达实验：用脂质体LipofectamineTM 2000将30 nM及50 nM的miR-21模拟物分别转染HUVEC,然后与0.1uM的阿托伐他汀共孵育48小时。Western Blot法检测细胞中PTEN及p-Akt的蛋白表达水平；Q-PCR法检测细胞中miR-21和PTEN表达；In Vitro Angiogenesis Assay检测管样结构长度。5. Smad3-siRNA干扰抑制实验：用脂质体LipofectamineTM 2000将60 nM的Smad3-siRNA转染HUVEC,然后与0.1 uM的阿托伐他汀共孵育48小时。Western Blot法检测细胞中Smad3、PTEN及p-Akt的蛋白表达水平；Q-PCR法检测细胞中miR-21表达；In Vitro Angiogenesis Assay检测管样结构长度。结果1.给予阿托伐他汀喂食小鼠4周后,后肢缺血肌肉组织中Smad3蛋白以及miR-21表达明显增加,同时缺血组织毛细血管数目明显增多(所有P<0.01)。2. HUVEC中Smad3、p-Akt蛋白以及miR-21表达随着阿托伐他汀浓度(0.0001 uM,0.001 uM及0.1 uM)的升高而呈浓度依赖性增加,同时HUVEC形成管样结构的总长度明显增加；而PTEN蛋白表达水平明显降低(所有P<0.01)。3.MiR-21抑制剂(10nM、30nM、50nM及100 nM)呈浓度依赖性明显下调0.1 uM阿托伐他汀孵育的HUVEC中p-Akt蛋白及miR-21的表达,同时减少了HUVEC形成管样结构的总长度；然而上调了HUVEC中PTEN蛋白的表达(所有P<0.01),而对PTEN mRNA表达无明显影响(所有P>0.05)。4.MiR-21模拟物(30 nM及50 nM)明显上调0.1 uM阿托伐他汀孵育的HUVEC中p-Akt蛋白及miR-21的表达,同时增加HUVEC形成管样结构的总长度；然而明显下调HUVEC中PTEN蛋白的表达(所有P<0.01)而对PTEN mRNA表达无明显影响(均P>0.05)。5. Smad3-siRNA转染后HUVEC中Smad3、磷酸化的Akt蛋白以及miR-21表达明显下降,同时HUVEC形成管样结构的总长度明显减少；而HUVEC中PTEN蛋白表达却明显增加(所有P<0.01)。结论1.阿托伐他汀有促进缺血肌肉组织中Smad3蛋白及miR-21的表达以及血管新生作用；阿托伐他汀有促进HUVEC中Smad3、p-Akt蛋白及miR-21的表达以及血管新生作用,同时抑制了PTEN蛋白的表达。2.MiR-21介导了阿托伐他汀诱导的HUVEC的血管新生作用。3. Smad3/miR-21介导了阿托伐他汀诱导的HUVEC的血管新生作用,其机制可能与抑制了内皮细胞中PTEN的表达,进一步激活Akt有关。