【摘 要】
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背景与目的:骨肉瘤发病率高、恶性程度高、易转移,其中远处转移是导致患者疗效不佳和预后不良的重要因素。他汀类药物主要用于降血脂,近年来也被发现具有抑制肿瘤增殖及转移的作用,但目前在骨肉瘤方面的研究较少。研究报道,YAP和SOX9在骨肉瘤中均高表达,且与骨肉瘤细胞的迁移、侵袭有关。此外,课题组前期生物信息学预测发现,SOX9可能是YAP下游的靶基因。因此,本研究的目的是验证辛伐他汀是否可以通过调控YA
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背景与目的:骨肉瘤发病率高、恶性程度高、易转移,其中远处转移是导致患者疗效不佳和预后不良的重要因素。他汀类药物主要用于降血脂,近年来也被发现具有抑制肿瘤增殖及转移的作用,但目前在骨肉瘤方面的研究较少。研究报道,YAP和SOX9在骨肉瘤中均高表达,且与骨肉瘤细胞的迁移、侵袭有关。此外,课题组前期生物信息学预测发现,SOX9可能是YAP下游的靶基因。因此,本研究的目的是验证辛伐他汀是否可以通过调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移,并在此基础上进一步探索辛伐他汀抑制骨肉瘤转移的相关机制,以期丰富骨肉瘤转移的研究内容和研究现状。方法:第一部分:首先检测辛伐他汀的作用靶点（HMGCR）在骨肉瘤细胞中的活性以及辛伐他汀是否能抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭;其次检测敲低SOX9后骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的变化;然后检测辛伐他汀处理后骨肉瘤细胞SOX9的表达;最后通过双荧光素酶标记实验,检测辛伐他汀对骨肉瘤细胞SOX9启动子活性的影响。第二部分:首先对SOX9启动子区域进行分析,预测出TEAD与SOX9启动子可能的结合区域;其次通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）对各预测结合位点进行筛选和验证;然后通过构造相应结合位点缺失的含SOX9启动子区域的双荧光素酶报告基因载体,检测其与TEAD结合后SOX9启动子活性的改变,进一步筛选出具体的结合位点;最后检测敲低YAP或TEAD后SOX9的表达。第三部分:首先检测骨肉瘤细胞中YAP磷酸化和细胞定位,以及YAP敲低后骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的变化;其次检测辛伐他汀对YAP磷酸化和细胞定位的影响;最后通过Ch IP技术检测YAP与SOX9启动子的结合能力是否受辛伐他汀的调控。第四部分:首先检测RhoA在骨肉瘤细胞中的表达以及辛伐他汀处理后RhoA活性的变化;其次过表达RhoA后,检测辛伐他汀对YAP活性以及SOX9表达的影响;然后检测辛伐他汀对细胞骨架组装的影响;最后检测RhoA抑制剂（C3转移酶）和细胞骨架抑制剂（细胞松弛素D）处理后,骨肉瘤细胞YAP活性和SOX9的表达。第五部分:通过裸鼠尾静脉注射骨肉瘤细胞诱导肺转移的方法,评估辛伐他汀能否抑制骨肉瘤肺转移、能否延长裸鼠生存时间;此外通过免疫组化法检测裸鼠骨肉瘤肺转移结节中RhoA、YAP以及SOX9等蛋白的表达。结果:第一部分:HMGCR在骨肉瘤细胞中高表达;通过辛伐他汀下调甲羟戊酸的代谢,明显抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT;骨肉瘤细胞中SOX9的高度激活状态有助于其迁移、侵袭和EMT;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控骨肉瘤细胞SOX9的转录活性。第二部分:SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因;SOX9启动子区域内的TB1位点,是TEAD与SOX9结合并调控SOX9转录活性所必须的。第三部分:骨肉瘤细胞中YAP的活性高度上调,与骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT过程密切相关;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控YAP的活性,进而抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭;通过下调甲羟戊酸的代谢,辛伐他汀可明显降低YAP和SOX9启动子结合。第四部分:RhoA在骨肉瘤细胞中高表达;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控RhoA活性和细胞骨架的组装,进而抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭;辛伐他汀通过RhoA调控细胞骨架的组装,进而抑制YAP活性及下游SOX9的转录。第五部分:辛伐他汀在体内对骨肉瘤肺转移有明显的的抑制作用,主要表现为降低肺转移的发生率（20%vs.80%）及肺转移结节的数量（0.2个/只vs.1.6个/只）,延长裸鼠的生存期（P<0.05）等三个方面;RhoA、YAP以及SOX9在骨肉瘤肺转移结节中呈明显高表达状态。结论:RhoA、YAP和SOX9在骨肉瘤细胞中高度激活,促进其迁移、侵袭。辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调节SOX9表达来调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;而SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因,辛伐他汀通过RhoA和细胞骨架调节YAP活性来调控SOX9转录。同时,辛伐他汀在体内可抑制骨肉瘤细胞肺转移。综上,辛伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制RhoA的细胞膜定位,干扰细胞骨架组装,下调YAP活性,降低YAP靶基因SOX9转录,进而抑制骨肉瘤转移。
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