牙鲆(Paralichthys olivaceus)属于鲽形目牙鲆科,是我国非常重要的海水养殖经济鱼类之一,其典型的胚后变态发育是研究不对称发育机制的良好模型。牙鲆变态发育的主要特征是外部形态上由左右两侧对称的眼睛发生移位到左侧,并且生活方式由浮游性变为伏底性。在这个过程中各组织也发生了重构,其结构与功能发生了变化,这些变化被认为是由于基因的组织特异性表达所致。业已表明,这些基因的组织特异性表达是直接或间接受甲状腺激素的诱导,用外源甲状腺激素处理变态前的牙鲆会导致变态提前发生,而用甲状腺激素抑制剂硫脲处理则可以使变态停滞。在牙鲆变态发育过程中除了甲状腺激素诱导外,micro RNA也发挥着重要的作用。Micro RNA是一类由22个左右的碱基组成的非编码小分子RNA,通常在翻译水平负调控靶基因m RNA的表达。Micro RNA是基因组编码的内源性小分子RNA,需要经过加工才能成为成熟的有功能的Micro RNA。动物mi RNA的加工成熟通常需要Drosha和Dicer两个RNaseⅢ酶的参与。其中Drosha酶主要负责在细胞核内将mi RNA前前体pri-mi RNA切割成前体pre-mi RNA,pre-mi RNA在输出蛋白export 5的作用下,由细胞核输出到细胞质,在细胞质内Dicer将其加工成成熟体mi RNA。本论文系统研究了甲状腺激素对Drosha基因表达的影响以及甲状腺激素受体与Drosha酶之间的相互关系,然后进一步应用生物信息学和双萤光素酶基因报告系统验证micro RNA的靶基因以及它们在牙鲆变态发育过程中的功能,以期为进一步揭示甲状腺激素诱导牙鲆变态发育的机制研究提供理论依据。本研究取得了如下研究成果:1.甲状腺激素对牙鲆Drosha基因表达的影响首先,从牙鲆组织中克隆了Drosha基因c DNA全长,通过生物信息学软件分析了其结构特点,结果显示,牙鲆Drosha含有两个RNase-Ⅲ结构域,即酶的催化中心。与其他物种进行了比对分析,发现牙鲆Drosha氨基酸序列与其他物种的相似性在71%-91%之间,说明Drosha蛋白是比较保守的。然后通过Real-time PCR法检测了牙鲆Drosha基因在各组织及发育时期的表达图式,结果显示Drosha基因在脑和肌肉中高表达,在鳃和肾中表达量较低,未受精卵中几乎不表达,除出膜3天时表达较低外,其他发育时期表达量都比较高。在牙鲆变态期间,甲状腺激素下调Drosha基因的表达水平,表明甲状腺激素可以影响Drosha基因的表达。2.甲状腺激素受体与Drosha蛋白相互作用的免疫共沉淀在仔鱼出膜后14天用甲状腺激素处理仔鱼,出膜后第36天采集样本。牙鲆胚胎细胞用含50 nm甲状腺激素(T3)的培养基进行培养,48h后收集细胞,提取组织和细胞的蛋白。采用Co-IP,利用抗兔THR(或抗兔Drosha)的多克隆抗体免疫共沉淀组织或细胞总蛋白(以Ig G为对照抗体),获得THR(或Drosha)免疫共沉淀复合物;经SDS-PAGE凝胶电泳分离THR(或Drosha)免疫共沉淀复合物,然后以抗兔Drosha(或抗兔THR)多克隆抗体进行Western Blotting检测。结果显示,施加外源甲状腺激素的时候,THR抗体免疫沉淀复合物中有Drosha的存在,反之,Drosha抗体免疫沉淀复合物中也有THR的存在;未添加甲状腺激素的时候,二者的相互作用检测不到。证明在外源甲状腺激素的作用下,二者存在相互作用。3.Drosha对micro RNA和下游基因的调控作用利用Drosha-si RNA对Drosha基因进行靶向沉默,研究Drosha对micro RNA和下游基因的调控作用,为此设计合成了三条Drosha-si RNA序列,转染牙鲆胚胎细胞,用Realtime-PCR和Western blot技术筛选出了最优si RNA序列、作用浓度及作用时间,检测了Drosha基因靶向沉默后对mi RNA和下游基因表达的影响。结果表明:(1)Drosha-si RNA2沉默效果最好;(2)Drosha-si RNA2干扰组,浓度为2μg/ml,转染时间为48h时沉默效果最好;(3)Drosha沉默后对micro RNA的前前体pri-mi RNA无影响,但显著影响micro RNA的成熟。(4)Drosha基因沉默后,可以促进细胞凋亡;(5)Drosha基因沉默后,对细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2)有上调作用,而对细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)有下调作用。4.micro RNA的靶基因验证及其在牙鲆发育中的作用以mi R-1,mi R-133a,mi R-17为例,用生物信息学和双萤光素酶基因报告系统相结合预测并验证了micro RNA的靶基因,分析了靶基因在牙鲆变态发育中的作用。结果表明,HDAC4是mi R-1,mi R-133a的靶基因,α-TM是mi R-133a的靶基因,Cdc42是mi R-17的靶基因。然后利用RACE技术克隆了HDAC4,α-TM和Cdc42基因c DNA的全长,并通过Real-time PCR法检测了这三个靶基因在牙鲆各组织及发育时期的表达图式。结果表明,HDAC4和α-TM在各组织均有表达,但在肌肉中表达最高,二者在各发育时期的表达趋势比较一致,都是在胚胎期已经开始表达,在出膜3天时达到第一个顶峰,不同的是α-TM的第二个表达峰值出现在出膜后第29天,而HDAC4出现在出膜后第36天。用外源甲状腺激素处理仔鱼后发现,外源甲状腺激素可以促进HDAC4和α-TM的表达,而硫脲则抑制了二者的表达。Cdc42和mi R-17在各组织和发育时期均有表达,Cdc42在卵巢和脑中高表达,mi R-17在脑,鳃,胃和肠中高表达,而在卵巢中表达量非常低,从组织表达情况来看,Cdc42和mi R-17的表达趋势是相反的。从各发育时期的表达情况来看,Cdc42在胚胎期的表达呈现逐渐升高的趋势,而mi R-17在此阶段的表达趋势是逐渐下降的,出膜后,Cdc42的表达逐渐升高直到变态开始(17d),而后逐渐下降,而到变态高峰期(29d)又达到了17天的表达水平,随后继续升高,36天时达到顶峰,而后开始下降。而mi R-17在出膜后3天时就达到了一个高峰,17天时反而降低,直到29天时表达水平升高,36天时达到了顶峰。用外源甲状腺激素处理仔鱼后发现,外源甲状腺激素可以降低Cdc42的表达,而上调mi R-17的表达。综上所述,HDAC4和α-TM是mir-1,mir-133a的靶基因,其在肌肉中对细胞分化或增殖的作用部分是通过mir-1,mir-133a实现的。Cdc42是mi R-17的靶基因,并且从表达情况来看,二者在组织和发育时期的表达趋势是相反的,并且对外源甲状腺激素的反应也是相反的,其在细胞周期调控中部分是通过mi R-17发挥作用的。总之,本研究从mi RNA的角度初步探讨了甲状腺激素调控牙鲆变态的机制。分析了mi RNA的加工酶Drosha,在牙鲆各组织及发育时期的时空表达谱,以及外源甲状腺激素在牙鲆变态时期对Drosha基因表达的影响;检测了甲状腺激素受体与Drosha蛋白之间的相互作用关系以及Drosha基因对下游基因和mi RNA的调控;预测并验证了在牙鲆变态期间对甲状腺激素反应敏感的3个micro RNA的靶基因,分析了靶基因在牙鲆发育过程中的作用,通过以上实验得出,在牙鲆胚后变态发育中存在着一条甲状腺激素诱导的信号通路:甲状腺激素-甲状腺激素受体-Drosha-micro RNA-靶基因-牙鲆变态。此信号通路的发现为甲状腺激素诱导牙鲆变态提供了新的理论依据。