β-半乳糖苷酶是一种在食品工业中有着广泛应用的酶制剂。近年来,有关β-半乳糖苷酶的应用开发主要受制于稳定性低、有机溶剂耐受性差、重复利用率低等因素,这些因素限制了β-半乳糖苷酶在食品工业的进一步应用。β-半乳糖苷酶枯草杆菌芽孢表面展示技术是一种将β-半乳糖苷酶固定化于芽孢表层蛋白的一种固定化技术,由于枯草杆菌芽孢具有高稳定性和抗逆性,使得芽孢可以成为一个优良的固定化载体。但是,展示在芽孢上的β-半乳糖苷酶酶活性较低一直制约着该生物催化剂的发展。本研究采取三种不同类型的展示机制将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶展示在枯草杆菌芽孢表面,然后对这三者的展示效率以及酶学特性进行分析,优化芽孢展示机制,筛选出最适用于食品工业的生物酶制剂。首先,选用不同嗜温微生物来源的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型黏附模块（cohesin）与对接模块（dockerin）,成功构建5种基于脚手架骨架（cohesin-dockerin）相互作用原理的β-Gal芽孢表面展示体系:β-Gal-DocⅠ-1/CotG-CohⅠ-1、β-Gal-DocⅠ-2/CotG-CohⅠ-2、β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3、β-Gal-DocⅡ-1/CotG-CohⅡ-1、β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1,其酶活分别为1.9、1.86、1.97、1.71、1.64 U/mg芽孢（干重）。而β-Gal与锚定蛋白直接融合表达展示系统CotG-β-Gal和基于P_cry1Aa启动子表达的无锚定蛋白的β-Gal芽孢表面展示系统P_cry1Aa-β-Gal的酶活则分别为1.83U/mg和2.48 U/mg芽孢（干重）。免疫荧光显微镜和Western blot分析证实上述β-Gal芽孢表面展示系统均构建成功。其次,选取酶活相对较高的β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3和较低的β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1、CotG-β-Gal、P_cry1Aa-β-Gal这三种基于不同展示机制构建的β-Gal芽孢表面展示体系,利用Dot blotting测定每组芽孢表面固定的β-Gal分子数,P_cry1Aa-β-Gal单个芽孢表面展示β-Gal分子数达1.3×10⁵,CotG-β-Gal为4.3×10⁴,β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3和β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1分别为3.0×10⁴和2.8×10⁴。对比各组酶活和蛋白表达量的差异,结果表明基于cohesin-dockerin相互作用原理的β-Gal芽孢表面展示系统的β-Gal展示效率对啊,最高,CotG-β-Gal次之,P_cry1Aa-β-Gal最低。最后,考察重组芽孢β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3、β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1、CotG-β-Gal、P_cry1Aa-β-Gal以及游离的β-Gal（从无锚定蛋白芽孢表面展示系统中解离得到）的酶学特性。不同芽孢表面展示体系中β-Gal的最适pH均为6.0,最适温度均为75℃;在热稳定性和有机溶剂耐受性方面,CotG-β-Gal>β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3,β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1>P_cry1Aa-β-Gal;在循环使用6次后,各类重组芽孢酶活并没有丧失太多,残余酶活均保持在60%左右;β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3和β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1的K_m值分别为3.83 mM和3.71 mM,CotG-β-Gal为4.43mM,P_cry1Aa-β-Gal为5.71 mM。综上所述,相比于β-Gal-DocⅢ-1/CotG-CohⅢ-1和P_cry1Aa-β-Gal二者,直接融合展示型CotG-β-Gal和基于优化的脚手架蛋白展示型β-Gal-DocⅠ-3/CotG-CohⅠ-3有着较高的酶活和优良的酶学特性,十分适用于食品工业催化领域。