论文部分内容阅读
背景来自两个或两个以上个体的混合检材是法医物证检验中经常遇到的疑难检材类型之一。随着高灵敏检测技术、高多态性和性连锁等特殊遗传标记的普及应用,从混合检材中获取证据信息的能力不断提高。但即使对于经验丰富的专家来说,实际案件中一些混合检材的检测和结果解释仍然是一个巨大的挑战。如何对组份含量差异较大的混合检材中的少量成份进行分型,是当前法医DNA分析的难题之一。目的建立人类Y染色体M175插入/缺失基因座的COLD-PCR(co-ampLification at lower denaturation temperature PCR)技术,比较COLD-PCR与常规PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果,初步探讨COLD-PCR用于法医混合检材中低水平等位基因富集扩增分型的可行性。方法首先建立人Y-M175基因座的常规PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)银染法分型技术,调查103名河南汉族男性无关志愿者的基因型。用蛋白酶K消化-酚/氯仿法提取插入和缺失型个体的基因组DNA,按不同比例混合制备成混合样品。用梯度保温异源双链消减法测定M175大扩增子(171/166bp)的临界变性温度(critical denaturation temperature,Tc),高分辨率熔解率曲线法(high resolution melting analysis,HRM)测定M175短扩增子(91/86bp)的Tc值。以Tc值为基础,通过在常规PCR的变性和退火之间增加扩增产物杂交和异源双链变性两个步骤,分别建立和优化基于PAGE-银染法(大扩增子)和实时定量法(小扩增子)的COLD-PCR技术,比较常规PCR和COLD-PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果。结果河南汉族Y-M175基因座插入和缺失型的频率分别为0.1650、0.8350。M175大扩增子的Tc值为76.4℃,小扩增子的Tc值为78.4℃,优化后采用的COLD-PCR异源双链变性温度分别为76.4和78.2℃。大扩增子PAGE-银染法,常规PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为5∶1,而COLD-PCR至少可以达到20∶1。小扩增子实时定量法,常规PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为16∶1,而COLD-PCR至少可以达到64∶1。结论使用与常规PCR相同的设备和试剂, COLD-PCR能实现混合样品中微量等位基因的富集扩增,扩大可分型混合检材的范围,改进分型效果,在混合检材的法医DNA分型中有潜在应用价值。