氧化还原酶广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等方面。大多数的氧化还原酶催化反应都需要辅酶，在其所需辅酶中，NAD(P)+-NAD(P)H体系占90％左右。但这些辅酶价格昂贵，限制了氧化还原酶的应用。采用基因工程技术对酶法再生辅酶中的关键酶进行克隆和高表达是解决氧化还原酶辅酶再生的关键。赭色掷孢酵母中乙醛还原酶可以催化4-氯-乙酰乙酸乙酯(COBE)为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(R-CHBE)，该不对称还原反应需要还原性辅酶NADPH参与，因此R-CHBE的高效制备需要辅酶再生循环的耦合。　　 本论文的主要内容包括：①高效表达甲酸脱氢酶构建辅酶NADH再生体系；②高效表达葡萄糖脱氢酶构建辅酶NADPFH再生体系；③乙醛还原酶的克隆和表达；④乙醛还原酶与辅酶再生体系偶联转化4-氯-乙酰乙酸乙酯。　　 本论文首先构建了高效的辅酶NADH再生系统：根据甲酸脱氢酶基因序列，设计引物，扩增甲酸脱氢酶基因，构建重组质粒pET-fdh转化进入大肠杆菌进行表达，经过宿主和载体、诱导时间、诱导温度等参数优化，重组菌中甲酸脱氢酶比酶活达到0.409U/mg蛋白，重组蛋白表达量约占全菌可溶性蛋白的17％，得到了高效表达甲酸脱氢酶的重组菌Rosetta/pET-fdh。　　 本论文构建了高效的辅酶NADPH再生系统：根据葡萄糖脱氢酶基因序列设计引物，扩增葡萄糖脱氢酶基因，构建重组质粒pET-gdh并转化入大肠杆菌进行表达。重组菌葡萄糖脱氢酶比酶活高达9.65U/mg蛋白，重组蛋白表达量占全菌可溶性蛋白的53％。获得了高产葡萄糖脱氢酶的基因工程菌株。　　 本论文实现了乙醛还原酶在大肠杆菌中的高效表达，并研究了乙醛还原酶与辅酶再生体系耦合催化不对称还原反应：通过RT-PCR从真核生物赭色掷孢酵母中克隆了乙醛还原酶cDNA序列，构建了重组表达载体pET-alr，转化入大肠杆菌BL21中。重组菌经诱导后乙醛还原酶比酶活达到4.091U/mg蛋白，显著高于原始菌株赭色掷孢酵母。以重组菌BL21/pET-alr和BL21/pET-gdh双菌混合选择性还原COBE，产物CHBE的转化率在7h时达到85.19％，22h后达到95.88％，产物R-CHBE的光学纯度为92％。双菌双酶的COBE转化率和转化速率均显著优于BL21/pET-alr的单菌转化。该双菌双酶转化体系无需添加辅酶，实现了高效的辅酶再生与耦合还原催化。　　 本论文高效表达了甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，构建了良好的辅酶再生体系，并将葡萄糖脱氢酶和乙醛还原酶偶联，大幅度提高了辅酶循环再生的效率，高效的辅酶再生体系将进一步促进氧化还原酶在生物催化工业中的应用。4-氯-3-羟基丁酸乙酯