【摘 要】
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禽流感病毒（Avian Influenza Viruses,AIVs）属于正黏病毒科、A型流感病毒属。2013年以来,我国各地区开始爆发H7N9亚型禽流感,直到2018年,共报道了5波大流行。2016年7月份,本课题组在流行病学调查中首次监测到1株高致病性（High Pathogenicity,HP）H7N9亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/16876/2016（以下简称为16
【基金项目】
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国家自然科学基金（31672586、31830097）； 广东省重点领域研发计划项目（2019B020218004）； 国家肉鸡产业技术体系项目（nycytx-42）； 广东省“珠江学者”特聘教授专项； 长江学者奖励计划青年学者；
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禽流感病毒（Avian Influenza Viruses,AIVs）属于正黏病毒科、A型流感病毒属。2013年以来,我国各地区开始爆发H7N9亚型禽流感,直到2018年,共报道了5波大流行。2016年7月份,本课题组在流行病学调查中首次监测到1株高致病性（High Pathogenicity,HP）H7N9亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/16876/2016（以下简称为16876）,其血凝素（HA）裂解位点上插入了4个氨基酸“KRTA”。2017年1月,广东省疾病预防控制中心在2例人感染H7N9的病例中分离到的病毒中也发现,其HA裂解位点有氨基酸的插入,即由PKGR/G突变为PKRKRTAR/G,提示该病毒具有了对禽类高致病性的分子特征。本研究对2016年到2019年在我国出现的HP H7N9AIVs的HA基因序列进行了系统性的分析,并选取了1株H7N9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/SD12/2019（以下简称为SD12）作为流感疫苗供体毒株进行研究。本研究删除了SD12的HA基因裂解位点附近决定其高致病力的连续性氨基酸（将PKRKRTAR/G突变成PKG----R/G）,以此减弱其毒力。接着利用本课题组先前构建的A/Duck/Guangdong/D7/2007（H5N2）8质粒反向遗传系统,将SD12的NA基因及改造后的HA基因与D7疫苗株的6个内部基因（PB1、PB2、PA、NP、M、NS）一起,拯救出1株H7N9亚型禽流感疫苗候选种毒株,命名为H71903。将重组病毒H71903灭活并制备成油乳剂疫苗,与H7N9亚型商品化疫苗r GD76（制苗株为16876）一起通过颈部皮下注射免疫21日龄SPF鸡,0.3 m L/只,采集二免后的鸡阳性血清,同这两株疫苗毒株及2016年到2019年分离到的其余十株H7N9亚型的禽流感病毒进行血清交叉试验,结果表明重组禽流感灭活疫苗H71903的抗体效价整体高于r GD76疫苗。将重组灭活疫苗H71903在4℃保存3个月后进行性状和无菌检验,实验结果均符合规定。同时将灭活疫苗H71903分别经颈部皮下和肌肉注射两种途径进行一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种21日龄SPF鸡和10日龄麻黄肉鸡,安全性试验结果表明,灭活疫苗H71903对SPF鸡和麻黄肉鸡均无明显的毒副作用,剖检注射部位无明显的炎症反应,证明疫苗对这两种靶动物均具有良好的安全性。对150日龄海兰褐蛋鸡的一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种的安全性试验表明,免疫后鸡的精神状态良好,采食与饮水正常,实验组与对照组的产蛋率无明显差异,表明该疫苗对产蛋鸡的产蛋率无影响,使用安全。使用灭活的H71903疫苗通过颈部皮下注射免疫40只SPF鸡,然后将其平均分为四个组,同时每组另设置5只未免疫的SPF鸡作对照。结果显示,免疫灭活疫苗H71903 21日后SPF鸡的抗体效价几何均数（GMT）为7.0log2～7.5log2之间。同时将四株H7亚型的攻毒毒株A/Chicken/Shandong/SD1115/2018（H7N2）、A/Chicken/Shandong/SD12/2019（H7N9）、A/Chicken/Hebei/He B1908/2019（H7N9）、A/Chicken/Liaoning/LN/2019（H7N9）分别稀释成100 LD50,通过滴鼻接种的方式对免疫组和未免役组进行攻毒,0.2 m L/只。攻毒后的第5 d采集所有存活鸡的泄殖腔和咽拭子,拭子检测结果显示免疫鸡均未检测出病毒,未免役的鸡都检测到了病毒。攻毒试验14 d后,免疫鸡全部存活,而未免疫鸡在3～6日内全部死亡。结果表明,免疫重组禽流感灭活疫苗H71903可以诱导SPF鸡产生较高的抗体水平,对麻黄肉鸡、SPF鸡和海兰褐蛋鸡具有良好的保护期和安全性,同时可以保护SPF鸡抵抗H7亚型的禽流感病毒的攻击。H71903株重组病毒可作为为理想的防控新型高致病性H7N9亚型禽流感的灭活疫苗种毒候选株。
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