CYFIP1过表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移能力影响的研究

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目的:抑癌基因与肿瘤的发生发展密切相关,抑癌基因的异常表达可影响肿瘤细胞的生物学功能。在我们前期实验发现候选抑癌基因CYFIP1在鼻咽癌组织及细胞系中低表达或表达缺失的基础上,本课题将研究CYFIP1过表达对鼻咽癌细胞系CNE2迁移、增殖能力的影响,探讨其在鼻咽发生发展中发挥的作用。  方法:1、分别设计并包装含CYFIP1基因片段和空载片段的慢病毒,感染人类CYFIP1低表达鼻咽癌细胞株CNE2,嘌呤霉素筛选得到稳定细胞株,分别为实验组和空载组,未处理的细胞为对照组。2、应用蛋白印迹法(Western Blotting,WB)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)测量不同组别细胞中CYFIP1基因和蛋白的表达水平。3、细胞划痕试验和Transwell迁移试验研究CYFIP1对鼻咽癌细胞迁移能力的影响,测量细胞迁移距离和记录穿膜细胞数;检测不同组别细胞中E-钙粘蛋白(E-cadherin)编码基因的表达情况。4、分别于细胞培养24、48、72、96h采用MTT实验观察各组细胞增殖情况(以OD值表示)。进行细胞克隆形成实验,待平板中出现肉眼可见克隆时,终止培养并计算克隆形成数。荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)试剂染色处理细胞后,流式细胞仪检测细胞周期。  结果:1、CYFIP1在实验组、空载组和对照组中基因和蛋白表达情况:CYFIP1mRNA的相对表达量分别为3.491±0.169、1.079±0.037、1.00±0.01,CYFIP1蛋白相对表达量分别为0.326±0.018、0.169±0.013、0.149±0.011。与空载组、对照组相比,实验组中CYFIP1基因和蛋白水平表达均明显增高,P均<0.05,差异具有统计学意义。2、CYFIP1对鼻咽癌细胞迁移能力影响:实验组、空载组、对照组细胞相对迁移距离为(6.71±0.1)、(9.82±0.12)、(9.98±0.1)mm,实验组细胞迁移距离小于空载组和对照组(P均<0.05)。Transwell迁移实验中实验组、空载组和正常组的穿膜细胞数量分别为37.33±1.53、62.67±5.03、62.13±4.36个,实验组穿膜细胞数少于空载组和对照组(P均<0.05)。E-钙粘蛋白编码基因mRNA在实验组、空载组和对照组中相对表达量分别为1.316±0.166、1.070±0.033、1.00±0.01,与空载组、对照组相比,实验组中E-钙粘蛋白编码基因mRNA表达明显增高,P<0.05,差异具有统计学意义。3、CYFIP1对鼻咽癌细胞增殖能力影响:MTT试验中三组细胞不同培养时间OD值相比,P均>0.05,各组细胞的增殖情况基本一致,差异无统计学意义。细胞克隆形成试验中实验组、空载组和对照组细胞克隆形成数分别为414±29、426±30、381±59个,三组相比P均>0.05,差异无统计学意义。细胞周期检测中实验组、空载组和对照组S期细胞分别为(23.773±3.586)%、(22.253±2.089)%和(24.963±1.896)%,不同细胞组之间无明显差异,结果无统计学意义(P均>0.05)  结论:1、成功构建慢病毒转染后CYFIP1稳定过表达的CNE2细胞株。2、在鼻咽癌中CYFIP1基因表达与肿瘤增殖能力无明显相关,而是与肿瘤迁移侵润有关,CYFIP1可能参与了鼻咽癌的发生发展。CYFIP1可能参与了鼻咽癌的浸润和发展,有望成为预警鼻咽癌转移的分子标志物。
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