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氧为生命活动所必须,低氧性损伤和耐受参与了临床多种疾病的发生,如窒息、高原反应、脑卒中、心肌梗死,以及癌细胞耐药和转移等。脑由于耗氧量高而对氧缺乏反应最敏感。缺血/低氧预适应(I/HPC),作为一种内源性保护机制,是指短暂、亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发组织器官对继发严重缺血/低氧性损伤产生耐受。这一现象最初于1986年由美国学者Murry在心脏组织中发现,随后人们又在脑、肺、肝和肾等组织器官中均观察到此现象的保护效应。
大量研究报道,I/HPC通过其不同耐受机制来对抗多种损伤,如兴奋性毒性、离子或pH失衡、氧化应激、代谢功能失调、炎症反应、凋亡和死亡等,起到神经保护作用；I/HPC耐受机制涉及多条信号通路激活,如一氧化氮合酶、低氧诱导因子、热休克蛋白、促红细胞生成素和脑源性神经营养因子等参与的信号通路,来减轻缺血/低氧性损伤。值得引起关注的是,丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族介导的信号通路是多种刺激的共同通路,也是近年来缺血低氧领域研究的热点之一。本课题组利用已建小鼠整体低氧预适应(HPC)模型发现,HPC可以明显降低大脑中动脉阻塞(MCAO)所致脑缺血性损伤,包括缓解神经行为学损伤、降低脑皮层梗死体积和减少皮层半影区神经原细胞的凋亡；HPC还可以明显增强缺血半影区内p38MAPK的磷酸化水平,从而提示p38MAPK可能参与了I/HPC的神经保护作用。然而,究竟是p38MAPK介导的哪些信号通路参与其中目前尚无定论。丝裂原和应激激活的蛋白激酶-1(MSK-1)是p38MAPK下游激酶之一,主要在心脏、脑和胎盘等组织中表达。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是位于MSK-1下游的一种转录因子,在神经系统特别是脑的神经元中含量丰富。MSK-1和其底物CREB在HPC中的作用尚不明确。本研究拟进一步证实I/HPC的神经保护效应；验证p38MAPK的激活在HPC神经保护机制中的作用,并探讨其下游激酶MSK-1及其作用底物CREB在HPC降低脑缺血性损伤中作用,从而进一步丰富人们对脑I/HPC信号转导机制的认识。
实验在室温20-22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。将动物分为常氧假手术(NS)、HPC假手术(HS)、常氧缺血(NI)、HPC缺血(HI)、DMSO和p38MAPK抑制剂(HI+SB)等6组。小鼠在HPC(低氧暴露4次)处理后1h,再进行MCAO致脑缺血模型的制备。术后6h通过观察神经行为学改变、脑皮层梗死体积和水肿率的变化,探讨HPC对缺血脑组织的神经保护作用；利用侧脑室注射p38MAPK抑制剂SB203580,验证p38MAPK在HPC脑保护过程中作用；应用蛋白印迹(Western blot)方法,观察皮层缺血核心区(Ic)、半影区(P)和缺血对侧皮层(C)组织内HPC对MSK-1和CREB磷酸化水平及蛋白表达量的变化,探讨I/HPC神经保护作用的分子机制。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和t-检验进行统计学处理,并以均数±标准差或标准误((X)±S.E.)表示,其中p<0.05为差异显著。实验结果如下:
1.随着低氧暴露次数的增加,小鼠对低氧的耐受时间逐渐延长
与低氧暴露1次(H1,17.8±0.6min)相比,重复低氧暴露2次(H2,25.4±0.8min)、3次(H3,30.8±0.9min)和4次(H4,35.6±1.3min)小鼠的低氧耐受时间明显增加(p<0.05,n=50),提示本实验成功地制备了小鼠HPC模型。以下HPC小鼠特指低氧暴露4次小鼠。
2.HPC明显缓解MCAO致脑局部缺血小鼠神经行为学改变
MCAO致脑局部缺血6 h后利用盲法进行小鼠神经行为学评估。在单项神经行为学指标中发现,左侧脑局部缺血损伤都可导致明显的神经行为改变,而HPC可明显缓解神经行为学改变；如活动减少(95％vs79％)、侧倾姿势(94％vs92％)、扁平姿势(88％vs83％)、转圈(76％vs71％)、低反应性(41％vs33％)、前肢屈曲(100％vs96％)、前肢肌力下降(88％vs83％)和运动失调(100％vs98％)等；在神经行为学综合评价中,HPC同样明显改善小鼠皮层缺血后神经行为学的综合评分(6.33±0.25 vs7.90±0.27,p<0.05,n=20)。
3.HPC明显降低小鼠脑梗死体积和水肿率
2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色结果显示,假手术组脑切片未见梗死灶,呈均匀红色；MCAO可诱发明显局灶性脑缺血,梗死灶呈苍白色。与常氧缺血组相比,HPC明显降低MCAO致脑缺血皮层梗死体积(19.62±3.90％vs30.52±1.94％,p<0.05,n=12)及脑水肿率(6.31±0.47％vs12.06±1.64％,p<0.05,n=12)。
4.p38MAPK抑制剂对HPC脑保护作用的影响
本课题组既往研究发现,HPC可明显增强缺血皮层半影区p38 MAPK磷酸化水平。通过侧脑室注射p38MAPK抑制剂SB203580,观察p38MAPK在脑HPC形成中的作用。与HI+DMSO组相比,注射SB203580明显加重小鼠神经行为学损伤(8.30±0.21 vs6.90±0.31,p<0.05,n=20)、增加小鼠缺血皮层梗死体积(34.62±2.38％vs18.09±1.89％,p<0.05,n=6)和水肿率(10.84±0.89％vs7.64±1.38％,p<0.05,n=6)。而注射DMSO组并没有明显影响脑梗死体积(P>0.05,n=6)和脑水肿率(p>0.05,n=6)。这些结果提示注射p38 MAPK抑制剂SB203580部分取消了HPC的脑保护作用,HPC通过p38MAPK介导的信号通路减轻小鼠缺血性脑损伤。
5.p38MAPK抑制剂对MSK-1磷酸化水平和蛋白表达量的影响
侧脑室注射p38MAPK抑制剂SB203580(5 nmol/L)可明显抑制皮层缺血核心区(70.21±6.21％vs100％,p<0.05,n=3)和半影区(104.78±11.47％vs129.64±9.69％,p<0.05,n=3)MSK-1的磷酸化水平,但总蛋白量无明显改变(p>0.05,n=3)。以上结果提示:p38MAPK下游激酶MSK-1可能也参与了HPC的形成过程。
6.HPC对缺血皮层内MSK-1磷酸化水平和蛋白表达量的影响
MSK-1是p38MAPK下游的重要激酶,本实验检测了HPC对小鼠缺血皮层内MSK-1磷酸化水平的变化。Western blot结果显示:MCAO致小鼠脑皮层缺血6h可明显降低皮层缺血核心区内MSK-1磷酸化水平(48.78±11.68％,p<0.05,n=4),而半影区仅有轻微下降:与常氧缺血组相比,HPC对缺血核心区MSK-1的磷酸化水平无显著影响(p>0.05,n=4),但HPC使半影区内MSK-1磷酸化水平明显增高(103.71±7.89％vs73.78±8.70％,p<0.05,n=4),总MSK-1蛋白表达量在皮层缺血核心区和半影区内均无明显变化(p>0.05,n=4)。
以上结果提示,I/HPC可能通过提高缺血半影区内MSK-1的磷酸化水平而不是改变MSK-1蛋白变化量的变化而减轻缺血性脑损伤。
7.HPC对缺血皮层内CREB磷酸化水平和蛋白表达量的影响
CREB是MSK-1下游底物,亦是一种广泛表达的细胞核内转录因子。在I/HPC对缺血小鼠脑内CREB磷酸化水平影响的研究中发现,MCAO所致皮层缺血后6h,皮层缺血核心区内CREB的磷酸化水平明显降低(55.64±8.12％,p<0.05,n=4),半影区内CREB磷酸化水平无明显变化；HPC对皮层缺血核心区CREB磷酸化水平无明显影响(p>0.05,n=4),但明显增加了皮层半影区内CREB磷酸化水平(143.11±8.08％vs109.30.±8.99％,p<0.05,n=4)；总CREB蛋白表达量在皮层缺血核心区和半影区均无显著变化(p>0.05,n=4)。上述结果表明,CREB的激活可能参与了I/HPC的脑保护作用。
综上所述,本研究发现HPC明显减轻MCAO致脑缺血性损伤、缓解缺血皮层半影区MSK-1和CREB的磷酸化水平的降低；证明p38MAPK可能通过激活MSK-1-CREB介导的信号通路参与HPC的神经保护作用。研究所获成果丰富了人们对脑I/HPC信号转导机制的认识,也为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供一定的实验依据。