癌症,又名恶性肿瘤,如今已成为仅次于心血管疾病的人类第二大“杀手”。化疗药物属于一类抗肿瘤药,可以杀伤肿瘤细胞,治疗癌症。人类历史上第一类具有化疗意义的药物——氮芥诞生于1942年,用于治疗淋巴瘤。从那以后,各种针对不同癌症类型的药物被发现并应于临床研究,与此同时,化疗药物的研发也进入了一个产业化阶段。虽然化疗对亚临床转移灶、转移灶、原发灶普遍有疗效,而化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时,也将正常细胞和免疫(抵抗)细胞一同杀灭,因此在某种程度上说,化疗是一种“玉石俱焚”的治疗方法。即便是在当今医疗水平高度发展的时代,化疗依然无法根治肿瘤,特别是中晚期患者。因此寻找具有高效的肿瘤靶向化疗药物成为人们追求的目标。理想的大分子前药特征是:当载药实体未到达病灶部位时以非活性形式存在,而当载药实体到达病灶部位后释放活性药物发挥疗效,这样不仅提高了药物在病灶部位的选择性汇集,减少了药物对正常组织和器官的毒副作用,而且可以使药物的实际使用剂量接近理论需要剂量水平。近几年,脂质体载药系统被认为是最有前途的靶向给药载体之一,从而得到了广泛的研究与应用。使用线性的PEG包覆在脂质体表面改变脂质体表面的电荷和亲水性从而改变脂质体与血浆蛋白的结合能力,增加了脂质体的稳定性以及体内循环时间。要使得PEG能插入到脂质体膜中,需要将其一端与疏水基团二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)连接,制备成两亲性的分子。连接的产物DSPE-PEG。聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯(TPGS)是维生素E的水溶性衍生物,由维生素E琥珀酸酯的羧基与聚乙二醇(PEG)2000酯化而成,TPGS对P糖蛋白有抑制作用,基于此,本文使用了DSPE-PEG2000/TPGS1000聚合物结束负载阿霉素(Doxorubicin,DOX),将阿霉素药物分子被包裹到胶束的核中,制备出了分子量可控、粒径较小、释放缓慢、生物相容性好、对肺癌细胞增殖有较强的抑制效果及细胞内吞,在血液循环中被有效地保护起来,使胶束组比小分子组有较长的血液循环时间,且显示出较好的抑瘤效果。简言之,这种简单的将阿霉素药单载于DSPE-PEG2000/TPGS1000聚合物结束胶束是一种对肺癌治疗有效的,在一定程度上可以避免药物的血液快速清除,从而提高抗癌疗效的理想的载药体系。癌症的转移和化疗耐药是癌症治疗的一个主要障碍,并导致超过90%的转移性癌症中治疗失败。阿霉素的治疗常常可以延长病人的生存时间,但是,在相当一部分病人中癌症最终可能出现多药耐药性,导致癌症的复发,转移或者死亡。单一给药不可能成功的治疗癌症。因此,联合使用多种非交叉耐受的抗癌药被临床上广泛采用。应用具有不同分子靶向的多种药物可以跨越基因屏障并延迟癌症的适应过程。多重药物靶向相同的细胞通路可以协同作用,引起更高的治疗效果和靶向选择性。总之,开发一种联合用药的方法可能对于增强抗癌效果和克服化疗耐受是非常关键的。姜黄素(curcumin,cur)属于姜黄这一姜科植物的关键组分,不仅具有抗肿瘤功效外,还可以降低阿霉素对正常组织的杀伤作用,长期使用也无显著不良反应。纳米科技的高度发展为抗肿瘤领域的新型联合用药开辟了前所未有的机会。在我们先前的工作中,相比于小分子药物,在体外和体内试验中利用dspe-peg2000/tpgs1000聚合物胶束传输抗癌药阿霉素已显示出较少的系统毒性和更大的抗癌效果。而部分研究中已证明了在同一纳米粒中负载两种抗癌药可以增强抑瘤和抗转移效率。实际上,由于纳米粒可以保证传输两种或更多的治疗药物到同一个细胞,它们能较好地适用于耐药性的逆转。因此,在本研究中,通过dspe-peg2000/tpgs1000载体构建了即负载有姜黄素又负载有阿霉素的聚合物胶束。考察了相对于这两种药物作为聚合物药物单独使用或小分子药物联合使用,它们对人肺癌细胞a549和耐阿霉素耐药的a549(a549/adr)两种细胞的抑瘤效果。本研究提供了一种联合的策略,使用一种聚合物载体来实现中药姜黄素和化疗药物阿霉素的联合治疗。通过体外对a549细胞和a549/adr细胞两种细胞的mtt评价测定证明协同效果的存在,这也从共聚焦显微镜观测到的细胞对胶束的内吞行为得到支持。而且聚合物胶束中共同负载姜黄素和阿霉素不仅可以延缓血液清除速度,还能协同抑制癌细胞的生长和增生,也利于缓解耐药性。因此,这种策略有望于将来在临床治疗癌症中使用,特别是耐药的病人。近年来,抗肿瘤药物的研究和治疗逐渐变得热烈,特别是在筛选抗癌药物方面,诱导细胞凋亡已成为新的方向,着眼于细胞凋亡的关键靶点,对癌症治疗具有重要意义。肿瘤的发生机理与细胞凋亡有密不可分的关系,尤其旺盛的细胞增殖诱发凋亡与增殖之间失去平衡时易发生肿瘤。肿瘤细胞的异常增殖属于外界或内源性刺激影响细胞周期所导致的的现象,往往是特异性地表达于细胞周期中G2期,进而定位在有丝分裂纺锤体的微管上,影响有丝分裂发挥抗凋亡功效。凋亡经激活caspase-7及caspase-3等终末效应蛋白酶,裂解DNA,拮抗有丝分裂的正常运行,最终发挥抑瘤效果。肿瘤发生发展的核心原因是大部分出现异常的因子对癌前细胞的生死平衡进行了病理性调控,而在肿瘤细胞而言,促凋亡因子的生理性激活过度或表达下调或活性丧失是肿瘤细胞区别于正常细胞的原因。所以,特异性促进肿瘤细胞的凋亡通路的激活或者阻遏抗凋亡通路成为抗肿瘤治疗的核心理念,无疑是抗肿瘤治疗有效且可行的途径。Bcl-2家族依据对细胞凋亡的功效分为两大类,一个是细胞凋亡促进因子,另一个是细胞凋亡抑制因子。(1)p53导致的细胞凋亡可被Bcl-2基因阻遏。p53属于促凋亡基因,Bcl-2属于抑制凋亡基因,p53所致的细胞凋亡可被高表达的Bcl-2所抑制,p53又可以经直接转录激活Bax,间接阻遏Bcl-2的表达。(2)通过调控钙离子分布,激活谷氨酰转移酶及内切酶,使细胞的跨膜转运受到影响。(3)Bcl-2还可以起到抗氧化效果,活性氧可致脂质氧化、破坏蛋白质、DNA损伤,最终使细胞凋亡受到抑制。(4)Bcl-2/Bax是凋亡的决定性关键要素,一般来说,Bax表达高于Bcl-2表达,可形成促细胞凋亡诱导核心物质-同源二聚体。Bax表达低于Bcl-2表达,可形成抑制细胞凋亡诱导核心物质-异源二聚体。(5)caspase家族及线粒体是细胞凋亡的关键枢纽,如caspase家族的活性被抑制,细胞色素C等促凋亡蛋白从线粒体释放受到明显抑制。基于此,本实验第三部分用载姜黄素和阿霉素纳米胶束用于人肺癌A549细胞,使用免疫组织化学染色法和western blotting测定蛋白Bcl-2,Bax的表达来研究载姜黄素和阿霉素的纳米粒是否经调控Bcl-2家族蛋白的表达,达到抗肿瘤作用。结果发现,载姜黄素和阿霉素纳米胶束抑制A549细胞的表达,Bcl-2蛋白表达受到抑制,Bax蛋白的表达增加。究其原因可能是载姜黄素和阿霉素纳米胶束阻止了凋亡蛋白caspase家族的激活,细胞毒性受到抑制,当Bax高于Bcl-2的水平时,同型二聚体的形成诱导细胞凋亡,最终达到抗肿瘤效果。不过,它到底是经调控线粒体膜上Bax还是胞浆中Bax,亦或是经此外途径进行调控,需要更深入的研究。因此,负载姜黄素和阿霉素胶束对A549细胞增殖可能与Bcl-2,Bax蛋白表达和调控有关。