论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的重要病原,PCV2含有2个主要的开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF2编码的衣壳蛋白(Cap)是主要结构蛋白,具有良好的免疫原性,是发展新型亚单位疫苗的良好靶蛋白。细菌菌影(Bacterial ghost,BG)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。一方面,BG也可以作为佐剂,增强机体对抗原的免疫反应;另一方面,BG可以做为递呈系统,把目的蛋白更好的递呈给抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)。本实验中,利用两种不同的递呈系统,分别把Cap蛋白锚定在菌影的周质与外膜上,并进行了免疫效果评价。为了评价递呈在菌影周质与外膜上的Cap蛋白对猪的免疫效果,本研究将Cap蛋白分别与Gene III和INP信号序列融合表达。同时把裂解基因E盒克隆于同一个载体中,分别构建重组载体p MD-GKB-Cap-E和p MD-28a-Cap-E,然后转化BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达。结果表明,递呈在菌影周质中与外膜上的Cap蛋白均可有效表达。然后分别以BL21(p MD-GKB-Cap-E)与BL21(p MD-28a-Cap-E)菌影免疫4-6周龄的仔猪,一免三周后二免,并监测抗体水平。二免二周后,ELISA检测免疫组抗体水平显著高于对照组,表明菌影可以良好的递呈Cap蛋白,并具有很好的免疫原性。PCR检测攻毒后每周猪体病毒血症的变化,BL21(p MD-28a-Cap-E)菌影免疫组没有检测到病毒血症。然而,对照组在攻毒后2周到4周都可以检测到病毒血症。攻毒后28 d,免疫组腹股沟淋巴中病毒载量比对照组的病毒载量大大减少,且差异显著(p<0.01)。同时,对照组与免疫组相比表现出更低的体重增长率(p<0.05)。以上表明,菌影递呈外源Cap蛋白可以起到良好的免疫保护效果。为了评价APP菌影作为Cap蛋白佐剂的免疫效果,我们以500μg r Cap蛋白分别与1010CFU APP菌影以及ISA 61佐剂混合乳化作为亚单位免疫组,同时设灭活苗免疫组免疫4-6周龄仔猪并进行免疫效果评价。r Cap+APP菌影免疫组通过血清学检测抗体表明,它可以刺激机体产生体液免疫反应,比r Cap+ISA61佐剂免疫组诱导出更高的抗体水平(p<0.05)。PCR检测攻毒后猪体病毒血症的变化,r Cap+APP菌影免疫组没有检测到病毒血症,然而,对照组在攻毒后2周到4周都可以检测到病毒血症。攻毒后28 d,r Cap+APP菌影免疫组腹股沟淋巴中病毒载量比对照组和r Cap+ISA61佐剂免疫组的病毒载量显著减少,且差异显著。同时,r Cap+APP菌影免疫组比对照组表现出显著增高的体重增长率(p<0.05)。以上结果表明,APP菌影可以作为良好的佐剂显著增强机体免疫反应,提高机体的抗病原感染能力。为了研究猪传染性胸膜肺炎与圆环病毒病二联苗,我们还尝试把Cap蛋白递呈表达于APP菌影中。首先我们把递呈质粒的表达元件从p MD19-T载体上克隆到穿梭载体p LS88与p GZRS-18上,然后把构建成功的两个质粒电转化到APP S8菌株中,Western blot和SDS-PAGE均没有检测到目的蛋白的表达,考虑到可能是Cap基因的启动子在APP中没有被识别。然后我们把APP外膜脂蛋白oml A基因启动子克隆到两个表达载体上,依然没有检测到目的蛋白的表达。我们推测可能是Cap蛋白在APP中表达量太小,不容易检测到。我们根据文献报道,又分别把sodc与T4启动子克隆到Cap基因上游,依然没有检测到目的蛋白。根据以上结果,我们推测,APP的RNA聚合酶可能不识别外源启动子,利用本身的启动子也很难大量表达外源蛋白。