枕颈部区域是由枕骨大孔区、寰椎、枢椎、颈2、3椎间盘及周围的软组织共同构成的,是人体头部与躯干连接的枢纽及重要的解剖位置。它与延髓生命中枢相毗邻,是头颈部活动功能的主要运动单元。枕颈部的畸形多由于胚胎发育过程中调控基因表达异常导致,常可累及椎基底动脉、延髓及神经,严重影响患者颈部活动功能,甚至导致病人瘫痪或死亡。然而到目前为止,尚缺乏针对该病的发病机制的研究,临床上针对这一病症,也没有有效的预防措施,对已有明显脊髓、神经压迫症状的患者,只能采取手术治疗。但手术难度和风险极大,所以该区域的手术常被称为是骨科手术的"危险区"、"禁区"。异补骨脂素是常用的补肾益精类中药补骨脂的主要有效成分之一,可促进成骨细胞增殖分化,在治疗骨骼疾病方面有突出的作用,其机制与TGF-β/Smads信号通路有密切的联系。本研究试图从动物和细胞水平,观察异补骨脂素干预对枕颈部先天性畸形的作用,以及初步探讨分析其作用机制与TGF-β/Smads信号通路的相关性。实验一 Hoxd3基因表达降低对枕颈部发育的影响与维生素A缺乏的相关性目的:本部分实验采用维生素A缺乏干预,制作先天性枕颈部畸形动物模型,观察研究畸形动物骨性结构形态的改变,探讨Hoxd3基因导致先天性枕颈部畸形的机制,以及此过程中与维生素A缺乏因素的相关性。方法:将30只初断乳的雌性SD大鼠随机分成维正常对照组（N）和维生素A缺乏组（VAD）。VAD组给予维生素A缺乏饲料喂养,N组予以普通大鼠维持饲料喂养。于VAD组雌鼠出现明显的维生素A缺乏症状及血清维生素A含量明显降低且低于200 ng/ml时,予以两组雌鼠交配处理。两组孕鼠妊娠第11.5天取两组半数孕鼠的胚胎,采用RT-qPCR检测胚胎中Hoxd3及视黄酸受体基因表达的改变;于妊娠第21天取新生鼠整体骨骼标本,采用骨骼双重染色法处理后,在体视镜下观察两组新生鼠枕颈部结构的形态的改变。结果:VAD组胚胎中Hoxd3及视黄酸受体mRNA表达明显降低（P<0.05）;镜下观察新生鼠枕颈部结构发生明显的结构畸形,如寰椎和枢椎发育不良,寰枕关节和寰枢关节骨性融合或对位异常等。结论:（1）结果表明胚胎发育期Hoxd3基因表达降低可导致枕颈部骨骼的发育畸形;（2）维生素A缺乏干预后,胚胎中视黄酸受体的表达也出现了下降,这表明了维生素A的体内代谢物视黄酸可能通过与其受体结合参与调控枕颈部骨骼发育的进程。实验二TGF-β1/Smad信号通路在异补骨脂素干预先天性枕颈部畸形中的作用目的:本部分实验通过异补骨脂素干预维生素A缺乏孕鼠,检测胚胎中Hoxd3、TGF-β1及其下游相关Smad蛋白的表达,观察异补骨脂素对改善新生鼠先天性枕颈部畸形的作用,初步探索异补骨脂素通过TGF-β1/smad信号通路在枕颈部发育中与Hoxd3基因表达的相关性。方法:将60只雌性SD大鼠随机分成正常对照组（N）、模型组（VAD）、低、中、高三种剂量的异补骨脂素干预组（ISL、ISM、ISH）。VAD、ISL、ISM、ISH组造模方法同第一部分。于雌鼠妊娠第0.5天（E0.5）开始使用异补骨脂素持续灌胃至E21。应用RT-qPCR 检测 E11.5 胚胎 Hoxd3、TGF-β1、Smad4、Smad7mRNA 的表达;免疫组化法检测新生鼠枕颈部骨骼中TGF-β1的蛋白表达;骨骼染色后,镜下检查新生鼠枕颈部骨骼形态改变。结果:（1）VAD组可见典型的枕颈部骨骼畸形;ISL、LSM、LSH组可见枕颈部畸形发生率相较于VAD组有所降低,畸形的程度得到一定改善,但与N组比较仍然存在畸形,ISL、LSM、LSH组间畸形发生率和畸形改善情况无明显区别;（2）ISL、LSM、LSH组孕鼠胚胎中Hoxd3 mRNA的表达较VAD组都有显著的升高（P<0.05）,但随着补充剂量的提高,mRNA表达的提升差异无统计学意义（P>0.05）。同时TGF-β1、Smad4mRNA的表达显著提高（P<0.05）,而Smad7mRNA的表达则被抑制（P<0.05）;（3）ISL、LSM、LSH组TGF-β1蛋白的表达相较于VAD组有明显的提高（P＜0.05）,VAD组TGF-β1蛋白表达较N组明显下降（P<0.05）。结论:（1）三种剂量的异补骨脂素可以降低先天性枕颈部畸形的发生率,改善先天性枕颈部畸形的程度,其机制可能是异补骨脂素通过TGF-β1/smad信号通路上调了Hoxd3基因的表达。（2）视黄酸/受体信号通路和TGF-β1存在交互作用,可能导致维生素A缺乏在转录和翻译水平降低了胎鼠枕颈部区域TGF-β1的表达。实验三BMP-2/Smad信号通路在异补骨脂素诱导成骨细胞增殖中的作用目的:本部分实验采用异补骨脂素干预胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）,观察异补骨脂素对细胞增殖的影响,并检测BMP-2及Smadl、Smad5基因及蛋白的表达,探讨异补骨脂素促进成骨与BMP-2/Smad信号通路的相关性。方法:体外培养MC3T3-E1细胞,设立0M的空白对照组,用不同浓度的异补骨脂素(10^-1、102、10^-3、10.-4M)孵育细胞72h,采用MTT法检测不同浓度的异补骨脂素对细胞增殖活性的影响;采用(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4M)浓度异补骨脂素孵育细胞72 h,RT-qPCR 和 Western-blot 法分别检测细胞中 BMP-2 及其下游 Smad1、Smad5 mRNA和蛋白的表达。结果:（1）10^-1、10^-2、10^-3、10^-4M浓度的异补骨脂素浓度依赖性地促进MC3T3E-1的细胞增殖（P<0.05）,10^-1M浓度促进增殖作用稍有下降,但与10^-2M无显著统计学差异（P>0.05）;（2）10^-1 10^-2、10^-3、10^-4M浓度的异补骨脂素可明显刺激BMP-2、Smad1、Smad5mRNA和蛋白水平的表达（P<0.05）,其中10^-2M浓度刺激作用最强,10^-1M浓度作用稍弱,但与10^-2M浓度无显著统计学差异（P>0.05）。结论:（1）异补骨脂素可明显促进体外培养的MCT3T3-E1细胞的增殖;（2）异补骨脂素可通过上调BMP-2/smad信号通路促进成骨细胞增殖分化,从而发挥促进骨形成的作用。