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目的:将斑点金免疫渗滤技术检测的快速性与金标银染技术对检测信号级联放大的敏感性相结合,建立金标银染免疫渗滤技术;并研制土拉弗朗西斯菌金标银染免疫渗滤诊断试剂盒,为检测土拉弗朗西斯菌提供快速、敏感的方法。方法:1.利用蛋白芯片技术选择最佳的抗体组合,为金标银染免疫渗滤法检测试剂盒的研发选择合适的包被抗体和示踪抗体;2.柠檬酸三钠还原法制备胶体金并确定标记的最佳pH值和最佳蛋白标记量,优化标记胶体金的稳定条件,确定胶体金纯化的离心速度等;3.确定点样体系并制成免疫渗滤检测卡,通过十字交叉实验优化点样浓度、样品体积、探针浓度、银染试剂用量等反应体系;4.大量阴性实验确定cutoff值;5.使用经荧光定量PCR定量的土拉弗朗西斯菌为检测对象,评价该方法的灵敏度、特异性和重复性;6.通过金标银染免疫渗滤法和免疫层析法进行对模拟样品进行检测比较。结果:1.用蛋白芯片选择了小鼠抗土拉LPS单克隆抗体为捕获抗体,兔抗土拉多克隆抗体为示踪抗体;2.采用柠檬酸三钠还原法制备了15nm胶体金,胶体金颗粒均匀、分散度好;确定了兔抗土拉多克隆抗体与15nm胶体金结合的最佳pH值为8.0,二者结合的最佳浓度为24μg/ml;3.合适的包被抗体缓冲液为:0.01MPBS(NaCl0.15MPH7.4)含2%的异丙醇;银染试剂用量为:A、B液各25μl混匀,银染时间为2分钟;十字交叉实验确定最佳的抗体包被浓度为1mg/ml,最佳的样品体积为50μl,最佳的金标探针浓度为1:10;洗液用含0.1%Tween20的PBS效果较好,封闭液用1%PVP+1%Triton-X100效果较好;4.cutoff值确定:C_T值为210,CC值为160;金标银染免疫渗滤卡特异性较好、检测灵敏度为1.0×10~3CFU/ml,高于免疫层析;密封保存的检测卡80天内重复性良好;模拟样品进行检测:自来水样最小检出量为1.0×10~4CFU/ml;可乐和橙汁样品的最小检出量为1.0×10~6CFU/ml。结论:1.建立了金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌的方法;2.金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌敏感性高,特异性强,重复性好,并且有方便快捷、不需要特殊仪器设备等优点。