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严重烧伤后,心肌局部血流量迅速减少,发生缺血缺氧损害和心功能减退,不仅引起心功能不全,还可诱发或加重休克,成为烧伤早期缺血缺氧的重要启动因素之一。根据上述认识,提出了烧伤后早期缺血缺氧损害的“休克心”假说。PI3K是细胞内重要的信号转导分子。PI3K激活后在质膜上产生第二信使PIP3,进一步引起信号蛋白Akt活化。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-kB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等,进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等。PI3K/Akt信号途径在烧伤早期心肌细胞的表达、作用及调控机制尚不明确。我们假设:在烧伤早期心肌细胞遭受缺血缺氧损伤的同时,PI3K/Akt信号途径即被激活,并可能通过调控钙浓度、线粒体膜稳定性以及凋亡基因表达发挥抗凋亡作用,PI3K/Akt/HIF-1α则可能是这种抗凋亡作用的重要分子机制。本实验对这一假设进行了验证。一、材料方法:采用动物实验和体外实验相结合的方法。1.建立烫伤大鼠模型,应用RT-PCR检测心肌组织PI3K mRNA表达变化,Westernblot检测心肌组织PI3K及磷酸化Akt蛋白表达。2.建立体外培养的大鼠心肌细胞缺血缺氧模型,应用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002及激动剂IGF-1,并结合ELISA、激光共聚焦、TUNEL等方法等方法观察缺血缺氧条件下该信号通路对心肌细胞活力、LDH酶活性、线粒体膜电位、胞内钙浓度及凋亡率等指标的影响,明确PI3K/Akt信号途径在缺血缺氧心肌细胞中的作用。3.建立体外培养的大鼠心肌细胞缺血缺氧模型,应用RT-PCR观察PI3K/Akt对P53、C-myc、Bax、Bcl-2等凋亡相关基因以及HIF-1αmRNA的影响,并应用LY294002和Rapamycin,结合Western blot探讨可能存在的凋亡调控机制。二、主要结果与结论1.严重烧伤早期即有PI3K mRNA及蛋白的高表达,并伴有Akt磷酸化水平的显著增加,说明烧伤早期PI3K/Akt途径即被激活。2.缺血缺氧条件下,心肌细胞活力持续下降,PI3K/Akt抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt激活后,心肌细胞活力下降更为明显。表明该途径可能具有维持细胞活性,拮抗缺血缺氧损害的作用。3.缺血缺氧刺激导致心肌细胞细胞膜结构破坏,LDH漏出增加;LY294002抑制PI3K/Akt激活后,缺血缺氧心肌细胞培养上清中LDH活性较单纯缺氧组明显升高。表明PI3K/Akt能够维持质膜稳定性,防止因膜结构的破坏导致细胞死亡。4.心肌细胞在缺血缺氧刺激下,细胞凋亡量明显增加。LY294002抑制PI3K/Akt激活后,缺血缺氧心肌细胞凋亡加剧;予以IGF-1激活PI3K/Akt,缺血缺氧心肌细胞凋亡量明显减少。说明PI3K/Akt的激活能够拮抗缺血缺氧心肌细胞凋亡,是细胞的内源性保护反应。5.缺血缺氧6h后,心肌细胞胞内钙浓度明显升高,LY294002抑制PI3K/Akt激活后,缺血缺氧心肌细胞胞内钙浓度升高更为显著;予以IGF-1激活PI3K/Akt,缺血缺氧心肌细胞胞浆钙离子浓度较单纯缺血缺氧组明显下降。说明PI3K/Akt的激活能够减轻胞内钙超载,避免钙超载引起的后续凋亡反应。6.缺血缺氧刺激6h、12h后,线粒体膜电位明显下降,提示线粒体膜通透性增加;LY294002抑制PI3K/Akt激活后,缺血缺氧心肌细胞线粒体膜电位下降更为显著;予以IGF-1激活PI3K/Akt,缺血缺氧心肌细胞线粒体膜电位下降幅度明显减小,表明PI3K/Akt能够维持线粒体膜稳定性,防止因线粒体MPTP的开放而导致后续凋亡反应的启动。7.缺血缺氧心肌细胞PI3K/Akt信号途径的活化可以上调HIF-1αmRNA转录活性,同时PI3K/Akt及mTOR蛋白磷酸化均可以在蛋白水平上调HIF-1α的表达,以发挥HIF-1α的抗凋亡作用,拮抗心肌细胞的缺血缺氧损害。8.缺血缺氧条件下,心肌细胞PI3K/Akt的活化可通过上调HIF-1α表达,进一步调控凋亡相关基因表达,如降低心肌细胞野生型P53的表达,提高Bcl-2/Bax比值,增加C-myc等表达,以减少凋亡,提高细胞存活率。