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氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的细胞膜上具有大量膜结合的乙醇脱氢酶(membrane-bound alcohol dehydrogenase, mADH),能够不完全氧化多种伯醇及伯二醇生成相应的酸。已有研究表明,mADH与G oxydan的呼吸链尤其是抗氰呼吸密切相关,还可介导其它膜结合脱氢酶的电子转移,如葡萄糖脱氢酶。本课题组前期通过分离纯化和活性测定,鉴定出G. oxydans DSM 2003中存在的mADH的两个亚基(Ⅰ和Ⅱ),分别由adhA和adhB基因编码。本论文通过生物信息学手段鉴定出G oxydans DSM 2003中mADH的亚基Ⅲ；基于对亚基Ⅲ的功能研究,理性构建高效表达mADH的G oxydans工程菌,提高其对羟基酸的合成能力。首先,mADH亚基Ⅲ的鉴定及功能研究。通过序列比对在G oxydans DSM 2003基因组中发现假定的adhS,将该基因在G oxydans DSM 2003中过表达以及与adhAB共同表达,另以adhAB表达菌作为对照,通过对这三株工程菌中mADH转录水平、蛋白表达及催化活性的比较,发现亚基Ⅲ的高表达可使更多游离于胞内的亚基Ⅰ结合于细胞膜,使其能够表现出正常的生理活性,从而提高菌株mADH的催化能力。亚基Ⅲ的表达量是决定Goxydans中mADH活性的一个重要因素。其次,mADH的过表达对G. oxydans产羟基酸能力的影响。在1,2-丙二醇的摇瓶转化中,过表达菌株G. oxydans-adhABS可将D-乳酸的产量提高53.8%,转化效率从0.65 g/(l·h)提高到1.0g/(l·h)；在乙二醇的摇瓶转化中,G. oxydans-adhABS可将羟基乙酸的产量提高164%,转化效率从0.3g/(l·h)提高到0.78g/(l.h)。由此可见,mADH的过表达极大提高了G. oxydans对羟基酸的合成能力。将乙二醇的转化过程在7L发酵罐中放大,通过在线调节pH、提高溶氧水平以及流加底物等手段,G. oxydans-adhABS河在45 h内累积生成73.3g/l羟基乙酸,转化率为93.5%,转化效率提高到1.63g/(l·h)。利用发酵法直接转化乙二醇,45 h可合成羟基乙酸113.8 g／l,转化率为92.9%,转化效率进一步提高到2.53 g／(l.h),此羟基乙酸产量和转化效率均为目前所报道的最高水平。第三,mADH的过表达对G oxydans呼吸链及其它膜结合脱氢酶的影响。过表达菌株G oxydans-adhABS中各呼吸链元件(NADH脱氢酶除外)的转录水平均显示不同程度的上调,尤其是两个呼吸链末端氧化酶(细胞色素bo3和bd醌氧化酶)。在生长对数期,菌体的摄氧能力显著增强,培养36 h的生物量比对照菌增加26%-33%,可为醇催化反应尤其是直接发酵法转化提供了更多的生物催化剂。此外,G.oxydans-adhABS中其它膜结合脱氢酶的转录水平和催化活性也有一定的提高,尤其是膜结合乙醛脱氢酶(mALDH),其相对活性提高26%,也可在一定程度上加速G. oxydans-adhABS的产酸进程。第四,mADH差异过表达对G. oxydans中甘油氧化产物选择性的影响。已知mADH是转化甘油生成甘油醛的关键酶,基于mADH的活性差异,工程菌G. oxydans-adhABS和G. oxydans-adhS对甘油的转化率降低至30%,但对甘油酸的选择性分别增加7.9倍和7.6倍；相反,G. oxydans-adhAB对甘油的转化率高达94%,对二羟基丙酮的选择性增加到92.6%。表明mADH的差异过表达可显著改变G. oxydans对甘油氧化产物的选择性。