单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes; L. monocytogenes）简称单增李斯特菌，是一种重要的人兽共患革兰氏阳性机会致病菌，是李斯特菌病的唯一病原菌。单增李斯特菌可引起人和动物的菌血症、神经系统感染以及流产和死胎等临床病症，其感染的致死率高达25%左右。近年来，耐药性单增李斯特菌的不断出现以及现有抗生素细胞膜渗透力低等因素限制了单增李斯特菌的临床治疗手段。单增李斯特菌被宿主细胞吞噬后，其分泌的溶血素（listeriolysin O;LLO）与吞噬泡膜上胆固醇结合形成弧形或者圆形的孔道结构而裂解吞噬泡，使得吞噬泡内的细菌逃逸至细胞质中增殖；另外LLO还可诱导免疫细胞和组织细胞凋亡。LLO在细菌致病以及逃避宿主免疫攻击等过程中发挥着重要的作用，LLO敲除子不能合成及分泌LLO，并且不能从吞噬泡内逃逸至细胞质中，最后被吞噬溶酶体裂解而死亡，几乎不引起宿主的感染和损伤。但是将表达LLO的外源性质粒转化入LLO敲除子内，回补株致病力得以恢复。因此LLO是单增李斯特菌抗毒力药物研发最具潜力的靶标之一。本研究通过溶血实验和蛋白免疫印迹等实验发现漆黄素、杨梅黄酮、桑色素、黄芩素、白杨素和柚皮素等黄酮类化合物可直接中和单增李斯特菌培养物上清和纯化LLO介导的成孔活性。在细胞和细菌共培养体系内加入漆黄素可显著抑制吞噬泡内细菌逃逸、降低细菌对细胞的细胞毒性作用以及增强吞噬细胞对单增李斯特菌的裂解作用；在单增李斯特菌小鼠感染模型中，皮下注射纳米乳漆黄素制剂显著降低感染小鼠的死亡率以及相关靶器官（肝脏和脾脏）内细菌定殖数；整体和组织病理学观察显示，与对照组相比，药物治疗组小鼠的肝脏和脾脏的病理性损伤明显减轻；应用ELISA测定了肝脏和脾脏研磨液内炎症因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）含量，结果表明治疗组小鼠的炎症因子含量明显降低。体内外功能实验表明漆黄素可直接结合于LLO并抑制LLO介导的成孔活性，降低单增李斯特菌的致病力。本研究进一步应用计算生物学方法、定点残基突变和荧光淬灭等实验分析了漆黄素抗LLO活性的机制。结果表明漆黄素直接结合于LLO第四结构域Loop2中的Ile396和Loop3中的Lys433，“拉长”了Loop1和Loop2之间的距离而阻碍了LLO与胆固醇相结合而影响了其寡聚化，进而抑制了LLO的成孔活性。定点残基突变和荧光淬灭等实验验证了上述理论计算结果的准确性。理论计算结果和荧光淬灭实验结果表明，漆黄素与野生型蛋白和突变型蛋白的结合力大小为：LLOWT>LLOK433A>LLOI396A。胆固醇结合实验、LLO寡聚化实验和纯化LLO溶血实验表明漆黄素可明显降低LLO和胆固醇的结合能力以及减少LLO的寡聚体的形成，抑制LLO介导的溶血活性，但是药物对突变体LLO上述活性抑制作用的敏感性明显下降。杨梅黄酮、桑色素、黄芩素、白杨素和柚皮素等化合物分子结构同源性较高，但是其对LLO成孔活性的抑制作用差异性显著，其半数有效抑制浓度从0.46μg/ml到186.57μg/ml不等。本研究应用计算生物学方法在构效关系水平上分析了这一潜在的差异性抑制作用。结果表明上述化合物与漆黄素抗LLO活性机制相似，但是当抑制剂分子内的C1-C2为双键时，其抑制活性明显增强。本研究进一步地应用定点残基突变和荧光淬灭等实验验证了上述的理论计算结果。另外，本研究通过溶血实验、蛋白免疫印迹实验、荧光定量PCR和β-LacZ转录报告基因融合实验发现木犀草素在较低浓度下即可抑制单增李斯特菌培养物上清的溶血活性；木犀草素作用后单增李斯特菌菌体内外的LLO含量明显下降；但是木犀草素并不影响LLO编码基因（hly）的转录。体外构建PET-21a-LLO重组表达质粒，分别应用体外转录和翻译实验分析了木犀草素对hly的转录和翻译的影响，结果表明木犀草素特异性地抑制hly的翻译；将hly进行不同程度的截短，进一步分析并发现了木犀草素抑制hly mRNA翻译的潜在靶序列为其799-849nt（51nt）。中药是我国重要的瑰宝，具有生物学活性多样性、副作用小和耐药性低等特点，也是新药研发的重要资源。本研究以LLO为靶标在天然化合物中进行了抑制剂的筛选，阐明了木犀草素抑制hly翻译的机制；应用溶血实验、计算生物学方法和定点残基突变等实验分析和确证了漆黄素等化合物对LLO成孔活性的抑制作用及其机制；细胞感染实验和小鼠感染实验进一步验证了漆黄素对单增李斯特菌致病力的影响。综上所述，本研究为阐明中药抗感染机制研究提供了重要的实验依据，同时也为以LLO为靶标的单增李斯特菌抗毒力药物研发提供了重要的实验依据和先导化合物。