泽漆抗肿瘤活性部位筛选及主要成分杨梅素的作用

来源 :兰州大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:lynneselina
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[目的]泽漆Euphorbia helioscopia L.,是一种广泛生长于全国大部分地区的传统中草药,具有多种药理学作用,然而,对于泽漆的主要抗癌活性部位及其抗肿瘤机制目前仍不清楚。本研究将通过体外抗肿瘤活性实验确定泽漆的活性部位,对主要抗肿瘤活性成分进行初步分离和纯化,并探讨其中之一的黄酮类化合物杨梅素的抗肿瘤机制,为泽漆的开发利用提供实验依据,为中药抗肿瘤新药的研发提供理论支持。[方法]1.采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四种溶剂将泽漆全草提取为四种组分,用MTT法测定不同浓度的泽漆各萃取物对胃癌SGC-7901、肝癌HepG2、SMMC-772、BEL-7402、结肠癌SW-480细胞生长的抑制作用。选取抗肿瘤活性最强的泽漆乙酸乙酯萃取物进行进一步研究,光镜和电镜分别观察乙酸乙酯萃取物作用后肿瘤细胞的形态学和细胞超微结构变化;流式细胞仪分析肿瘤细胞周期及凋亡。2.采用硅胶、Sephadex LH-20、聚酰胺等柱色谱方法对泽漆乙酸乙酯部位化学成分进行初步分离和纯化,并根据其理化性质及波谱数据鉴定结构。3.MTT法检测不同浓度杨梅素对肝癌BEL-7402、HepG2、SMMC-7721细胞的生长抑制作用;流式细胞仪分析杨梅素对肝癌细胞BEL-7402细胞周期及凋亡的影响;RT-PCR、Western blot法检测凋亡相关基因和蛋白表达水平,探讨杨梅素诱导肝癌细胞凋亡的潜在机制。[结果]通过泽漆各萃取物体外抗肿瘤筛选实验(MTT法),结果表明泽漆乙酸乙酯和氯仿萃取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖作用,此作用呈浓度、时间依赖性。在相同的浓度和作用时间下,乙酸乙酯萃取物的抗肿瘤作用强于氯仿萃取物,其最高抑制率为80.91%。乙酸乙酯萃取物对五种肿瘤细胞的抑制作用强弱依次为SMMC-7721>BEL-7402>SGC-7901>HepG2>SW-480。泽漆正丁醇萃取物和石油醚萃取物在50-200μg/mL的浓度范围内对上述五种肿瘤细胞未表现出明显的抑制作用。与对照组相比,泽漆乙酸乙酯萃取物作用48h后SMMC-7721、HepG2、 SGC-7901细胞的形态均发生明显改变,且细胞数目减少,细胞培养液内细胞碎片及悬浮细胞增多。乙酸乙酯萃取物对肝癌细胞SMMC-7721具有细胞周期阻滞效应,使其阻滞在G1期,同时S期细胞减少,该阻滞效应随剂量的增加以及作用时间的延长而增强。在各时间段,100-200μg/mL浓度范围的萃取物均可引起亚二倍体峰(凋亡峰)的明显升高,在200μg/mL作用72h后凋亡峰值最高,为11.18%。凋亡双染实验检测发现150、200μg/mL的乙酸乙酯萃取物对肝癌SMMC-7721细胞具有显著的凋亡诱导作用,总凋亡细胞率分别为13.6-47.53%。通过透射电镜,我们发现乙酸乙酯萃取物对肝癌SMMC-7721细胞的超微结构有显著的改变,可以导致细胞核内染色质边凝;部分胞核缩小核仁减少或消失;细胞质内空泡形成:细胞器肿胀;细胞表面微绒毛数量减少。并且可以诱导自噬小体的形成。对泽漆乙酸乙酯部位进行了初步分离和纯化,得到5种化合物,分别鉴定为:没食子酸(1),杨梅素(2),槲皮素(3),山奈酚(4)和金丝桃苷(5)。杨梅素(50-200μM)对肝癌细胞BEL-7402、SMMC-7721和HepG2均具有生长抑制作用,呈时间和浓度依赖性,且杨梅素对肝癌细胞BEL-7402的抗增殖效果最为显著,100-200μM作用72h后的抑制率分别为30.82%、39.64%、46.59%。杨梅素对肝癌细胞BEL-7402具有明显的细胞周期阻滞作用,使其阻滞在S期,呈剂量-时间依赖性。杨梅素可引起亚二倍体峰(凋亡峰),在200μM作用72h后凋亡峰值最高,为17.59%。流式细胞仪凋亡双染实验进一步证实150、200μM的杨梅素作用于肝癌BEL-7402细胞后,细胞凋亡率明显增加,总凋亡细胞率分别为4.7-82.41%。RT-PCR法检测证实,杨梅素作用后的肝癌细胞BEL-7402中,Bax、细胞色素C、Caspase-3、Caspase-8、Fas和FADD基因的表达水平明显升高,而Bcl-2、P53和NF-kB的mRNA表达下降,Bax/Bcl-2比值升高。Western blot检测结果显示,Caspase-3、Caspase-8、Fas蛋白表达增加,P53和NF-kB蛋白表达下调。[结论]1.通过体外抗肿瘤活性筛选,泽漆各组分的体外抗肿瘤作用强弱依次为乙酸乙酯>氯仿>石油醚>正丁醇,乙酸乙酯部分是泽漆萃取物中主要的抗肿瘤活性部位。2.泽漆乙酸乙酯萃取物具有抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡作用。3.通过对泽漆乙酸乙酯部分的初步分离纯化,得到5种化合物:没食子酸(1),杨梅素(2),槲皮素(3),山奈酚(4),金丝桃苷(5)。4.杨梅素对肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用,并诱导凋亡,其机制可能与线粒体途径、Fas信号通路以及凋亡相关蛋白P53和NF-kB有关。
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