【摘 要】
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鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia,CIA)是由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)引起的免疫抑制病。CAV病毒基因组主要编码VP1、VP2和VP3三种蛋白,其中衣壳蛋白VP1是主要免疫原,其正确折叠需要调控蛋白VP2的辅助,且两者相互协调才能诱导中和抗体的产生。为有效提高VP1在原核表达系统中的蛋白表达量,本研究通过构建VP1的原核截短表
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鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia,CIA)是由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)引起的免疫抑制病。CAV病毒基因组主要编码VP1、VP2和VP3三种蛋白,其中衣壳蛋白VP1是主要免疫原,其正确折叠需要调控蛋白VP2的辅助,且两者相互协调才能诱导中和抗体的产生。为有效提高VP1在原核表达系统中的蛋白表达量,本研究通过构建VP1的原核截短表达重组质粒,纯化蛋白并制备相应的特异性抗体,进一步将VP1和VP2基因插入双启动子载体上,筛选稳定表达VP1和VP2的细胞株,为进一步研究CAV的致病机理以及研发CAV疫苗奠定基础。(1)VP1截短的原核表达及多克隆抗体的制备通过DNASTAR软件分析VP1蛋白的抗原性,依据其主要存在两个抗原表位聚集区,确定截短表达基因区域为N端16-615 bp(600 bp)和616-1350 bp(735 bp)。设计两对特异性引物通过PCR扩增基因片段,将其分别连接到pET32a(+)原核表达载体上,通过菌液PCR检测、双酶切和测序等鉴定重组质粒(命名为pET32a-VP1-600和pET32a-VP1-735),以IPTG于常温和低温诱导蛋白表达并鉴定表达形式。结果显示,构建的pET32a-VP1-600和pET32a-VPI-735两种重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导后表达VP1-600(38 kDa)和VP1-735(48 kDa)融合蛋白,该两种蛋白均主要以包涵体形式表达。因而以8M尿素溶解包涵体蛋白后应用镍亲和层析柱纯化,经SDS-PAGE鉴定显示获得了纯度较高的VP1-600和VP1-735融合蛋白,可以作为免疫原。将上述纯化好的蛋白分别与弗氏佐剂乳化,通过皮下多点注射新西兰白兔,经四次免疫后制备抗血清,通过间接ELISA进行抗体水平的检测,以Western Blotting方法检测多抗与VP1-600和VP1-735蛋白的免疫反应。结果获得了 ELISA效价分别为1:204800、1:819200的兔抗VP1-600和VP1-735蛋白的多克隆抗体,Western Blotting检测结果显示该抗体可有效识别相应目的蛋白,表明制备的多克隆抗体能应用于VP1蛋白的检测。(2)VP1和VP2基因共表达稳转细胞株的构建设计无缝克隆VP1、VP2的特异性引物,通过PCR分别扩增VP1、VP2全长基因,连接到双启动子真核表达载体pCB15,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经菌液PCR、酶切鉴定为阳性的克隆进行基因测序。测序结果显示,VP2和VP1成功连接到同一个pCB15载体。将构建好的重组质粒通过脂质体转染293T细胞,用终浓度为1.5 μg/mL嘌呤霉素筛选抗性细胞,通过PCR和Western Blotting对筛选的细胞进行VP1和VP2分别进行基因表达和蛋白表达的检测。结果显示可检测细胞中VP1和VP2基因以及表达的蛋白,表明已获得稳定共表达VP1和VP2的细胞株。综上所述,本研究构建了两个VP1的原核截短表达重组质粒,通过IPTG诱导表达蛋白获得了融合蛋白,制备了两种兔抗VP1多克隆抗体;将VP1和VP2基因连接真核双启动子表达载体pCB15,获得重组质粒后转染细胞,经过嘌呤霉素筛选,成功获得稳定共表达VP1和VP2的细胞株,为进一步基于VP1和VP2共表达的CAV诱导中和抗体产生的影响机制和开发疫苗奠定基础。
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