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纳米二氧化硅(Si02)广泛应用于几乎涉及微米Si02的所有领域,由于微米级游离SiO2是一种高毒性颗粒,经呼吸道吸入可引起矽肺和肺癌,与之有着相同化学组分的纳米SiO2颗粒因其粒径小(1-100nm),比表面积大,化学活性高,可能更易对机体尤其是肺脏造成损伤。国内外的实验研究表明纳米Si02具有细胞毒性及致实验大鼠出现肺组织损伤的作用,但其毒作用机制尚不清楚。随着表观遗传学水平调控作用的发现,微小RNA (miRNA)在细胞中广泛的调控作用正逐渐引起人们重视。miRNA参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物进程,近期许多研究证实miRNAs与调控细胞分化、肿瘤发生、生物机体病毒防御有着极密切的关系。有研究结果显示miRNA在肺损伤及纤维化进程中起调控作用。本课题组前期进行的实验研究发现,大鼠经气管一次性灌注纳米SiO2、Illumina HiSeq 2000测序技术分析纳米Si02致大鼠肺损伤miRNA表达谱变化的结果显示,染尘7、15、30d时,染尘大鼠的肺组织病理损伤以炎症为主,出现肺损伤差异表达上调的miRNA为miR-208；染尘60、90d时染尘大鼠的肺组织主要表现为肺间质纤维化,差异表达上调的miRNA为miR-18a。miR-208与miR-18a调控其靶基因参与肺组织发生纤维化过程的作用有待进一步验证。本研究使用纳米Si02对NR8383大鼠肺泡巨噬细胞株染毒,染毒上清液共培养CHL中国仓鼠肺成纤维细胞,运用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法分别检测miR-208、miR-18a表达量；构建miR-208模拟物／抑制物(mimics/inhibit)转染NR8383细胞、miR-18a mimics/inhibit转染CHL细胞,RT-qPCR、蛋白质印迹法(Western Blot)技术分别检测miR-208、miR-18a预测靶基因PDCD4mRNA、CTGF mRNA及蛋白表达,运用荧光素酶报告基因检测miRNA与靶基因结合位点；对染毒的NR8383细胞上清液进行酶联免疫吸附测定(ELISA法)检测TGF-β1含量,在CHL细胞内阻断TGF-β1信号通路,检测miR-18a表达量的改变,以此探明miR-208、miR-18a参与纳米Si02诱导肺损伤过程中对靶基因表达的调控作用,为阐明纳米二氧化硅毒性作用的分子机制提供可靠理论依据。实验结果如下：1.运用MTT法测得纳米Si02对NR8383细胞的半数抑制浓度(IC50)为0.638 mg/ml,95%可信区间为0.117-1.576 mg/ml.光镜下观察到40μg/ml纳米Si02染毒NR8383细胞24h后,贴壁生长的细胞数减少,细胞呈不规则形,大量粉尘粒子粘附在细胞壁上,细胞周围呈现无粒子圆晕状区域,部分细胞膨大并开始崩解,死亡细胞数目增多,培养基中可见死亡细胞碎片。40μg/ml纳米Si()2染毒NR8383细胞24h后,与空白对照组相比,纳米SiO2组miR-208表达量极低,未检测到循环阈值(CT值)。运用Targetscan.org对miR-208与PDCD4进行结合位点预测,保守的目标概率(Probability of Conserved Targeting, PCT)为0.59,提示PDCD4可能是miR-208调控的靶基因。]miR-208 mimics/inhibit转染NR8383细胞48h后,光镜、荧光显微镜下观察到NR8383细胞形态未见明显改变,转染率为85%。miR-208mimics/inhibit转染NR8383细胞48h后,与空白对照组相比,miR-208 mimics组、mimics NC组细胞增殖率分别为(100.43±15.54)%、(98.29±2.06)%,差异无统计学意义(P>0.05); miR-208 inhibit组、inhibitNC组细胞增殖率分别为(103.58±10.74)%、(109.74±10.06)%.差异无统计学意义(P>0.05)。miR-208mimics转染NR8383细胞48h后,与空白对照组相比,miR-208 mimics组、mimics NC组miR-208相对表达水平为152.32±0.4O、0.92±0.08,差异有统计学意义(P<0.01). miR-208 mimics/inhibit转染NR8383细胞48h后,与空白对照组相比测得,miR-208 mimics组、mimics NC组PDCD4 mRNA相对表达水平分别为6.00±0.04、0.35±±0.00,差异有统计学意义(P<0.05), miR-208 inhibit组、inhibit NC组PDCD4 mRNA相对表达水平分别为0.14±0.06、1.40±0.22,差异有统计学意义(P<0.05); miR-208 mimics组、mimics NC组PDCD4蛋白灰度值比值为10.68±0.33、5.11±0.10,差异有统计学意义(P<0.01), miR-208 inhibit组、inhibit NC组PDCD4蛋白灰度值比值为1.24±0.14、1.67±0013,差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示40μg/ml纳米SiO2染毒NR8383细胞并未引起细胞内miR-208表达水平的改变,过表达miR-208可导致PDCD4 mRNA、蛋白表达上调,抑制miR-208可致PDCD4 mRNA下调,蛋白表达水平差异不明显。miR-208有可能正调控或者间接调控靶基因PDCD4表达。2.0(阴性对照组)、10、20、40μg/ml纳米SiO2染毒NR8383细胞24h后,培养上清液与CHL细胞共培养24h, MTT法测得CHL细胞增殖率分别为(100.00±0.03)%、(107.43±2.58)%、(106.50±2.92)%、(112.07±2.13)%,40μg/ml纳米SiO2染毒组CHL细胞增殖率高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05),10、20μg/ml纳米SiO2染毒组与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。40μg/ml纳米SiO2染毒NR8383细胞上清液刺激CHL细胞24h后,以空白组为对照,miR-18a相对表达量为1.34±0.08,差异有统计学意义(P<0.05)。Targetscan.org预测miR-18a与CTGF结合位点结果Pcr值为0.45,提示CTGF可能是miR-18a所调控的靶基因。miR-18a mimics/inhibit转染CHL细胞48h后,光镜、荧光显微镜下观察到CHL细胞形态未见明显改变,转染率为90%。 miR-18a mimics/inhibit转染CHL细胞48h后,与空白对照组相比,miR-18a mimics组、mimics NC组细胞增殖率分别为(94.20±10.82)%、(103.28±10.84)%,差异无统计学意义(P>0.05)；miR-18a inhibit组、inhibit NC组细胞增殖率分别为(98.79±7.57)%、(97.58±10.79)%,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-18a mimics转染CHL细胞48h后,与空白对照组相比,miR-18a mimics组、mimics NC组miR-18a相对表达水平为247.45±0.07、1.09±0.08,差异有统计学意义(P<0.01)。miR-18a mimics/inhibit转染CHL细胞48h后,与空白对照组相比,miR-18a mimics组、mimics NC组CTGF mRNA相对表达水平分别为0.74±0.08、0.96±0.08,差异有统计学意义(P<0.05), miR-18a inhibit组、inhibit NC组CTGF mRNA相对表达水平分别为2.67±0.41、0.46±0.01,差异有统计学意义(P<0.05); miR-18a mimics组、mimics NC组CTGF蛋白灰度值比值分别为0.61±0.07、1.01±0.09,差异有统计学意义(P<0.01), miR-18a inhibit组、inhibit NC组CTGF蛋白灰度值比值分别为3.67±0.09、0.90±0.03,差异有统计学意义(P<0.01). miR-18a与CTGF结合位点的双荧光素酶报告基因分析结果显示,以mimics NC组为对照,miR-18a mimics对CTGF野生型的报告相对荧光值为0.50±0.02,突变型的报告相对荧光值为0.86±0.04,miR-18a对CTGF有较明显的下调作用,结果提示,miR-18a可通过CTGF3’UTR区的该位点调控基因的表达。10,20,40μg/ml纳米SiO2染毒NR8383细胞24h后,经ELISA法检测,细胞上清液中TGF-β1含量分别为642.0±2.5、810.0±3.6、1096.0±2.6 pg/ml,与阴性对照组920.0±5.1 pg/ml相比,40μg/ml组TGF-β1表达量增加,差异具有统计学意义(P<0.05); 10、20μg/ml组TGF-β1表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。分别给予CHL细胞5ng/ml TGF-β1、4nmol/ml TGF-β1受体阻断剂+5ng/ml TGF-β1培养24h后,以空白组为对照,TGF-β1组、TGF-β1+受体阻断剂组miR-18a相对表达水平分别为0.64±0.19、3.46±0.18,差异有统计学意义(P<0.05); TGF-β1组、TGF-β1+受体阻断剂组CTGF mRNA相对表达水平分别为5.49±0.81、0.28±0.07,差异有统计学意义(P<0.05); TGF-β1组、TGF-β1+受体阻断剂组CTGF蛋白相对表达量分别为1.15±0.18、0.62±0.01,差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示CTGF是miR-18a调控的靶基因,miR-18a参与TGF-β1信号通路,通过靶基因CTGF的3’UTR位点负调控CTGF的表达。综上,40μg/ml纳米SiO2染毒NR8383细胞未引起细胞内miR-208表达水平的改变,过表达miR-208可导致PDCD4 mRNA、蛋白表达上调,抑制miR-208可致PDCD4 mRNA下调,蛋白表达水平差异不明显,miR-208有可能正调控或者间接调控靶基因PDCD4表达：40μg/ml纳米SiO2染毒NR8383细胞上清液刺激CHL细胞增殖且miR-18a表达量增加,CTGF是miR-18a调控靶基因,miR-18a参与TGF-β1信号通路,通过与靶基因CTGF的3’UTR位点结合,负调控CTGF的表达,进而可能对肺纤维化的发生发展进程起调控作用。