胆道闭锁患儿循环microRNA的高通量测序分析

来源 :广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xraid
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景:胆道闭锁(BA)是发生在婴幼儿期的严重肝脏疾病之一,可导致肝内外胆道不同程度的纤维化闭锁。患儿生后不久就会出现阻塞性黄疸的症状,如不及时诊治可引起严重的胆汁淤积和迅速发展的肝硬化,随即出现肝脾肿大、腹水、静脉曲张、凝血功能障碍等门脉高压征象和肝功能失代偿,最终需接受肝移植。疏通胆道、恢复胆汁流的肝门空肠吻合术(Kasai术,葛西术)则是延长患儿自体肝生存、等待肝移植的姑息治疗手段。但Kasai术强调早期诊断和早期治疗,若术龄超过90天,胆汁引流失败率会明显升高,与肝移植之间的间隔时间明显缩短。近几年我国大陆地区虽然每年已有相当多胆道闭锁患儿接受了Kasai术,但是与国际上相比,我们的自体肝生存率前景堪忧。尽可能早的对BA患儿做出正确的诊断一直以来是小儿外科领域研究的热点和难点。  然而,直至目前为止临床上并未发现能确诊BA的单独检查方法,现有的一些BA特异的实验室指标(r-GT、TB、DB等)和影像学检查(B超、CT、ERCP、MRCP等)都无法将BA与其它婴幼儿胆汁淤积性疾病相鉴别,如何进行早期无创诊断仍是未解的难题。  近年来,国内外研究发现循环miRNA可作为多种疾病的诊断标志物,同时研究显示在BA患儿以及BA动物模型中皆存在miRNA表达与调控异常,提示miRNA可能参与BA的发病。研究人员用miRNA芯片技术发现miR-200/429家族在BA患儿血清中高表达,提示miR-200/429家族可作为BA的诊断标志物。本研究拟采用Illumina下一代高通量测序技术(NGS)筛选出BA特异性的miRNA表达谱,找出BA循环miRNA候选诊断标志物,为BA的无创性诊断提供科学依据,同时为BA的发病机制研究提供新的思路和线索。  目的:用Illumina高通量测序技术对BA患儿和正常对照组血浆miRNA进行测序,构建BA与对照组间miRNA文库。比较BA和对照组间miRNA的表达差异,从而构建BA特异性血浆循环miRNA表达谱。并进一步找出具有BA诊断性生物标志的miRNA,为寻找新的无创诊断标志物和发病机制研究提供依据。  方法:  1.用Illumina二代高通量测序平台Hiseq2000对BA患儿的血浆样本混合池和正常对照组血浆样本混合池的miRNA进行深度测序分析;  2.应用生物信息学分析BA患儿与健康婴幼儿对照组中血浆miRNA的表达差异,构建BA患儿特征性的miRNA表达谱;  3. RT-PCR扩大样本量验证BA特异性miRNA在BA组,胆汁淤积性疾病对照组和正常对照组间的差异表达,用2-ΔΔCt表示miRNA的相对表达量;  4.采用ROC曲线评估BA特异性miRNA在BA诊断中的应用价值;  5.用相关靶基因预测软件预测miRNA的靶基因和相关信号通路。  结果:  1. BA血浆miRNA差异表达分析  应用高通量测序分析,在BA组和正常对照组中,发现表达差异在2倍以上的miRNA有146个,其中15个miRNA归一化后的表达量大于1000,7个上调,8个下调,这15个miRNA构成BA循环miRNA表达谱。有6个miRNA归一化后的表达量大于5000,分别是表达上调的miR-122-5p,miR-100-5p和表达下调的miR-140-3p、miR-10b-5p、miR-26a-5p、miR-126-3p。  2.RT-PCR扩大样本量验证BA特异性miRNA的差异表达  针对测序结果筛选出的BA特异性miRNA,采用RT-PCR对44例BA患儿,20例胆汁淤积性疾病对照组患儿和20例正常对照组的血浆miRNA进行验证。与正常对照相比,miR-122-5p和miR-100-5p在BA患儿组血浆中的表达上调;miR-140-3p和miR-126-3p在BA患儿血浆中表达下调,与测序结果一致,差异有统计学意义(p<0.05)。与正常对照组相比,miR-122-5p和miR-100-5p在胆汁淤积性疾病对照组中的表达量高于正常对照组,差异有统计学意义。BA组与正常对照组和胆汁淤积性疾病对照组相比,miR-140-3p在BA中表达下调,差异均有统计学意义。miR-10b-5p和miR-26a-5p在三组之间表达均无统计学差异。  3. ROC曲线评估BA特异性miRNA在BA诊断中的应用价值  根据测序结果和RT-PCR验证结果,发现miR-140-3p在BA中特异性表达。miR-140-3p在评估44例BA与40例非BA人群(包括胆汁淤积性疾病和健康人群)的曲线下面积(AUC)为0.75,95%置信区间为0.644-0.856,p值<0.001。当最佳截断值(cut-off值)为0.083时,特异度为79.1%,灵敏度为66.7%。  4. BA特异性miRNA的靶基因预测  采用靶基因预测软件预测到miR-140-3p的靶基因FGF9、MMP家族、IGF-1R、PDGF、CTGF、TGF-βR1、Notch2、Wnt5A等与BA相关,这些靶基因参与胆管的发育和分化、肝纤维化的发生、细胞外基质的形成等。  结论:  1.本研究利用二代高通量测序技术成功构建了BA差异性miRNA表达谱,这些差异表达的miRNA与胆管的发育分化、细胞外基质的形成、肝纤维化的发生相关。其中部分miRNA为之前已研究发现的miRNA,部分为本研究新发现的miRNA。  2.通过采用stem-loop RT-PCR方法扩大样本量对表达丰度高、个体间表达稳定的6个差异miRNA进行单个样本验证分析,其中miR-122-5p、miR-100-5p、miR-140-3p、miR-126-3p验证的结果与测序结果一致,说明验证结果与测序结果的吻合度较高,并从中发现miR-140-3p在BA组、胆汁淤积性疾病对照组和正常对照组之间表达均具有统计学差异,提示miR-140-3p可作为BA的诊断标志物。  3.本研究结果提示miRNA的二代高通量测序为发现诊断标志物的研究方法,本课题研究发现的BA特异性miRNA将为BA的诊断、发病机制和治疗的研究提供新的线索。
其他文献
本文以公共人力贵潭管理的角度从职业发展的概念入手,阐述了辅导员职业发展的意义,对辅导员的职业发展维度进行了分析,并提出了职业发展的保障机制.
第一部分,BOLD功能MRI成像参数对图像质量影响的基础研究.目的:应用1.5TfMRI探讨回波时间(TE)与图像信噪比(SNR)、磁敏感伪影及功能区活动之间的关系.第二部分,正常运动皮质
请下载后查看,本文暂不支持在线获取查看简介。 Please download to view, this article does not support online access to view profile.
目的:联机血液透析滤过(联机HDF)和无醋酸盐生物滤过(AFB)为两种新型的肾脏替代疗法.已有肯定的资料显示,两者在多个方面要优于传统的血液透析疗法.该研究采用前瞻性、交叉的
为进一步探讨药物治疗PVR在抑制炎症及控制细胞的增殖方面的效应,研究人员应用流式细胞仪检测去炎松与维拉帕米联合作用于外伤性PVR兔眼玻璃体后不同时期玻璃体内细胞的增殖
构建社会主义和谐社会是我们党新一代领导集体对社会主义和谐社会理论思考的新突破.高校和谐,不仅是社会和谐的重要组成部分,而且对和谐社会建设具有引领、示范和推动作用应
热休克反应(Heat Shock Reaction/HSR,也称为应激反应,根据习惯,我 们沿用热休克反应这个名称),是细胞对外界不利环境适应或生存的一种自身保 护性机制;它伴随着热休克蛋白(Heat Shock Protein,Hsp)(也称应激蛋白) 的产生’~((1)(2))。Elizabeth A.Craig等~((14))认为热休克蛋白70
日本研究人员最新研究发现了一种白血病癌细胞的增殖机制,并找到了抑制其增殖的方法,这一发现将有助于开发治疗白血病等癌症的药物。东京理科大学的研究人员对白血病中的肥大
1 概述随着电子信息技术的发展、计算机应用的普及,计算机及其通讯技术在水利自动化工作中的运用越来越广泛,自动化是今后水利工作的发展方向。数据无线采集系统同相应的硬
1987~1989年于黑龙江省安达市进行了10万亩甜菜高产、高糖攻关试验,主要栽培措施是在总结当地常规栽培方法基础上结合几年来的田间试验结果制定的。施肥水平为氮素营养每亩7.5