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研究背景:胆道闭锁(BA)是发生在婴幼儿期的严重肝脏疾病之一,可导致肝内外胆道不同程度的纤维化闭锁。患儿生后不久就会出现阻塞性黄疸的症状,如不及时诊治可引起严重的胆汁淤积和迅速发展的肝硬化,随即出现肝脾肿大、腹水、静脉曲张、凝血功能障碍等门脉高压征象和肝功能失代偿,最终需接受肝移植。疏通胆道、恢复胆汁流的肝门空肠吻合术(Kasai术,葛西术)则是延长患儿自体肝生存、等待肝移植的姑息治疗手段。但Kasai术强调早期诊断和早期治疗,若术龄超过90天,胆汁引流失败率会明显升高,与肝移植之间的间隔时间明显缩短。近几年我国大陆地区虽然每年已有相当多胆道闭锁患儿接受了Kasai术,但是与国际上相比,我们的自体肝生存率前景堪忧。尽可能早的对BA患儿做出正确的诊断一直以来是小儿外科领域研究的热点和难点。 然而,直至目前为止临床上并未发现能确诊BA的单独检查方法,现有的一些BA特异的实验室指标(r-GT、TB、DB等)和影像学检查(B超、CT、ERCP、MRCP等)都无法将BA与其它婴幼儿胆汁淤积性疾病相鉴别,如何进行早期无创诊断仍是未解的难题。 近年来,国内外研究发现循环miRNA可作为多种疾病的诊断标志物,同时研究显示在BA患儿以及BA动物模型中皆存在miRNA表达与调控异常,提示miRNA可能参与BA的发病。研究人员用miRNA芯片技术发现miR-200/429家族在BA患儿血清中高表达,提示miR-200/429家族可作为BA的诊断标志物。本研究拟采用Illumina下一代高通量测序技术(NGS)筛选出BA特异性的miRNA表达谱,找出BA循环miRNA候选诊断标志物,为BA的无创性诊断提供科学依据,同时为BA的发病机制研究提供新的思路和线索。 目的:用Illumina高通量测序技术对BA患儿和正常对照组血浆miRNA进行测序,构建BA与对照组间miRNA文库。比较BA和对照组间miRNA的表达差异,从而构建BA特异性血浆循环miRNA表达谱。并进一步找出具有BA诊断性生物标志的miRNA,为寻找新的无创诊断标志物和发病机制研究提供依据。 方法: 1.用Illumina二代高通量测序平台Hiseq2000对BA患儿的血浆样本混合池和正常对照组血浆样本混合池的miRNA进行深度测序分析; 2.应用生物信息学分析BA患儿与健康婴幼儿对照组中血浆miRNA的表达差异,构建BA患儿特征性的miRNA表达谱; 3. RT-PCR扩大样本量验证BA特异性miRNA在BA组,胆汁淤积性疾病对照组和正常对照组间的差异表达,用2-ΔΔCt表示miRNA的相对表达量; 4.采用ROC曲线评估BA特异性miRNA在BA诊断中的应用价值; 5.用相关靶基因预测软件预测miRNA的靶基因和相关信号通路。 结果: 1. BA血浆miRNA差异表达分析 应用高通量测序分析,在BA组和正常对照组中,发现表达差异在2倍以上的miRNA有146个,其中15个miRNA归一化后的表达量大于1000,7个上调,8个下调,这15个miRNA构成BA循环miRNA表达谱。有6个miRNA归一化后的表达量大于5000,分别是表达上调的miR-122-5p,miR-100-5p和表达下调的miR-140-3p、miR-10b-5p、miR-26a-5p、miR-126-3p。 2.RT-PCR扩大样本量验证BA特异性miRNA的差异表达 针对测序结果筛选出的BA特异性miRNA,采用RT-PCR对44例BA患儿,20例胆汁淤积性疾病对照组患儿和20例正常对照组的血浆miRNA进行验证。与正常对照相比,miR-122-5p和miR-100-5p在BA患儿组血浆中的表达上调;miR-140-3p和miR-126-3p在BA患儿血浆中表达下调,与测序结果一致,差异有统计学意义(p<0.05)。与正常对照组相比,miR-122-5p和miR-100-5p在胆汁淤积性疾病对照组中的表达量高于正常对照组,差异有统计学意义。BA组与正常对照组和胆汁淤积性疾病对照组相比,miR-140-3p在BA中表达下调,差异均有统计学意义。miR-10b-5p和miR-26a-5p在三组之间表达均无统计学差异。 3. ROC曲线评估BA特异性miRNA在BA诊断中的应用价值 根据测序结果和RT-PCR验证结果,发现miR-140-3p在BA中特异性表达。miR-140-3p在评估44例BA与40例非BA人群(包括胆汁淤积性疾病和健康人群)的曲线下面积(AUC)为0.75,95%置信区间为0.644-0.856,p值<0.001。当最佳截断值(cut-off值)为0.083时,特异度为79.1%,灵敏度为66.7%。 4. BA特异性miRNA的靶基因预测 采用靶基因预测软件预测到miR-140-3p的靶基因FGF9、MMP家族、IGF-1R、PDGF、CTGF、TGF-βR1、Notch2、Wnt5A等与BA相关,这些靶基因参与胆管的发育和分化、肝纤维化的发生、细胞外基质的形成等。 结论: 1.本研究利用二代高通量测序技术成功构建了BA差异性miRNA表达谱,这些差异表达的miRNA与胆管的发育分化、细胞外基质的形成、肝纤维化的发生相关。其中部分miRNA为之前已研究发现的miRNA,部分为本研究新发现的miRNA。 2.通过采用stem-loop RT-PCR方法扩大样本量对表达丰度高、个体间表达稳定的6个差异miRNA进行单个样本验证分析,其中miR-122-5p、miR-100-5p、miR-140-3p、miR-126-3p验证的结果与测序结果一致,说明验证结果与测序结果的吻合度较高,并从中发现miR-140-3p在BA组、胆汁淤积性疾病对照组和正常对照组之间表达均具有统计学差异,提示miR-140-3p可作为BA的诊断标志物。 3.本研究结果提示miRNA的二代高通量测序为发现诊断标志物的研究方法,本课题研究发现的BA特异性miRNA将为BA的诊断、发病机制和治疗的研究提供新的线索。