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目的: 观察光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)对荷Heps肝癌移植瘤小鼠肿瘤生长及生存期、肿瘤局部及全身免疫效应、肿瘤微血管及肿瘤细胞促血管生成因子表达的影响，探讨PDT的免疫和微血管效应机制，为临床肝癌PDT提供实验依据。观察PDT联合CpG寡聚脱氧核苷酸(cytosine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotides，CpG ODN)局部治疗，对肿瘤生长及免疫效应的影响，探讨联合治疗的疗效和作用机制，为肝癌综合治疗提供新方法。
方法: 接种Heps肝癌细胞于ICR小鼠皮下，建立Heps肝癌移植瘤模型。移植瘤长径达0.9～1.2cm时，随机分为荷瘤对照组、免疫治疗组、PDT组和光动力免疫治疗(photodynamic immunotherapy，PDIT)组，每组均为28只小鼠。免疫治疗组于小鼠肿瘤局部注射CpG ODN100μg。PDT组于治疗前1日经小鼠尾静脉注入光敏剂PSD-007 20mg/kg，避光24小时后照射肿瘤局部。激光波长632.8nm，光斑直径2cm，功率密度为240～250mW/cm2，能量密度为215～225J/cm2。PDIT组于PDT后即刻肿瘤局部注射CpG ODN100 μg。(1) 自治疗当日起，隔日测量四组小鼠肿瘤长、短径，计算肿瘤体积和治疗后16天的抑瘤率。(2) 记录接种肿瘤当天开始至小鼠死亡的时间，计算各组小鼠平均生存时间。(3) 于治疗后2小时、6小时、24小时和72小时，各组分批处死5只小鼠。取肿瘤组织，石蜡包埋并切片，苏木素-伊红(hematoxylin-esosin，HE)染色后光学显微镜观察。(4) 取各组小鼠上述时间点的肿瘤组织切片，分别应用F4/80抗体、CD8抗体、CD34抗体和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体，行免疫组织化学染色。计数局部肿瘤组织中巨噬细胞、CD8+T细胞数量和微血管密度(microvessel density，MVD)值，并应用图像分析软件，对肿瘤细胞VEGF表达强度进行半定量分析。(5) 取各组小鼠上述时间点的血清，通过双抗体夹心法酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，检测干扰素(interferon，IFN)-γ和白介素(interleukin，IL)-12p70的水平。
结果:
1.免疫治疗组治疗后8天、16天，肿瘤体积较荷瘤对照组明显缩小(P<0.01)。PDT组和PDIT组治疗后48小时，肿瘤体积即较荷瘤对照组明显缩小(P<0.05)；治疗后8天、16天，肿瘤体积较荷瘤对照组及免疫治疗组均显著缩小(P<0.01)。PDIT组治疗后8天及16天，肿瘤体积较PDT组缩小更为显著(P<0.05)。免疫治疗组、PDT组和PDIT组治疗后16天的抑瘤率，分别为19.20％、96.26％、97.76％。
2.荷瘤对照组、免疫治疗组、PDT组和PDIT组小鼠平均生存时间，分别为22.50±6.48天、24.75±9.32天、72.25±12.23天、80.00±13.91天。免疫治疗组小鼠生存时间，较荷瘤对照组无明显差异(P>0.05)。PDT组和PDIT组小鼠生存时间，较荷瘤对照组及免疫治疗组均明显延长(P<0.01)。PDIT组小鼠生存时间，较PDT组稍有延长，但差异无统计学意义(P>0.05)。
3.HE染色结果显示，荷瘤对照组肿瘤细胞呈巢片状生长，坏死区少见，肿瘤组织中浸润少量炎症细胞。免疫治疗组治疗后2小时、6小时，肿瘤坏死较荷瘤对照组无明显变化；治疗后24小时、72小时，见小片状坏死区，炎细胞浸润较荷瘤对照组增多。PDT组治疗后2小时肿瘤细胞主要为空泡样变性，微血管扩张淤血；治疗后6小时肿瘤细胞空泡样变性、核固缩较前加重，微血管高度扩张，血液淤滞；治疗后24小时肿瘤细胞大片坏死，微血管破坏，肿瘤组织间可见弥散出血；治疗后72小时肿瘤组织大片凝固性坏死，微血管完全破坏，仅周边区域见少数残存微血管，周围环绕变性肿瘤细胞，肿瘤组织中可见大量炎症细胞浸润。PDIT组治疗后72小时，肿瘤细胞坏死情况和微血管变化与PDT组相似，炎症细胞浸润更为明显。
4.免疫组化染色结果显示，免疫治疗组治疗后24小时、72小时，肿瘤局部巨噬细胞数量明显高于荷瘤对照组(P<0.01)。PDT组治疗后2小时、6小时及72小时，PDIT组治疗后2小时、6小时、24小时和72小时，肿瘤局部巨噬细胞数量，较荷瘤对照组及免疫治疗组均明显增多(P<0.01或P<0.05)。PDT组治疗后24小时，肿瘤局部巨噬细胞较6小时有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，仍明显高于荷瘤对照组(P<0.01)。上述时间点，PDIT组肿瘤局部巨噬细胞数量显著高于PDT组(P<0.01或P<0.05)。
免疫治疗组治疗后72小时，癌巢内CD8+T细胞数量，较荷瘤对照组明显增多(P<0.01)。PDT组也于治疗后72小时，癌巢内CD8+T细胞数量显著增多，与荷瘤对照组和免疫治疗组相比，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).PDIT组治疗后72小时，癌巢内CD8+T细胞数量，较荷瘤对照组、免疫治疗组和PDT组均明显增多(P<0.05或P<0.01).
PDT后2小时～72小时，肿瘤区MVD进行性下降。治疗后2小时，肿瘤MVD即明显低于荷瘤对照组(P<0.01)；治疗后6小时较2小时有所下降，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后24小时，肿瘤MVD较6小时显著降低(P<0.05)；治疗后72小时，残存微血管数量极少。
PDT后2小时～72小时，肿瘤细胞VEGF表达较荷瘤对照组明显升高(P<0.01).治疗后6小时，肿瘤细胞VEGF表达强度达最高值，显著高于治疗后2小时、24小时和72小时(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。
5.ELISA结果显示，免疫治疗组治疗后24小时、72小时，血清IL-12p70的浓度较荷瘤对照组明显升高(P<0.01)；治疗后72小时，血清IFN-γ的浓度较荷瘤对照组明显升高(P<0.01)。PDT组和PDIT组治疗后2小时～72小时，血清IL-12p70的浓度，显著高于荷瘤对照组和免疫治疗组(P<0.01)。PDT组治疗后72小时，PDIT组治疗后24小时、72小时，血清IFN-γ的浓度也较荷瘤对照组和免疫治疗组明显升高(P<0.01或P<0.05)。PDIT组较PDT组升高更为显著(P<0.01或P<0.05)。
结论:
1.PDT可有效杀伤肝癌细胞，显著抑制肿瘤生长，明显延长荷瘤小鼠的生存时间。
2.PDT可诱导巨噬细胞和CD8+T细胞浸润肿瘤部位，升高血清IL-12p70和IFN-γ水平，激活荷瘤宿主局部及全身免疫功能。
3.PDT可破坏微循环，引起缺血缺氧，间接杀灭肿瘤细胞。
4.PDT联合肿瘤局部注射CpG ODN，可进一步增强荷瘤小鼠免疫效应，明显抑制肿瘤生长，疗效优于单独PDT。