论文部分内容阅读
3-羟基丙酸是一种重要的化工平台物质，广泛地应用于化工产品、高分子聚合物及农药中间体等化合物的合成中。作为当今世界最具开发潜力的化工产品之一，3-羟基丙酸的生物合成受到了各国研究人员广泛的关注。本文利用腈水解酶基因工程菌游离细胞与固定化细胞作为反应催化剂，以3-羟基丙腈为底物，合成了高浓度3-羟基丙酸，并探索了卤醇脱卤酶酶法催化合成3-羟基丙腈的方法。 本文以3-羟基丙腈为唯一底物，对本实验室现有的腈水解酶基因工程菌进行筛选，最终确定一株含有来源于环境微生物的腈水解突变株NIT190(AAR97489(Ala190His))基因的基因工程菌具有催化高浓度3-羟基丙腈的活力。通过对基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-NIT190进行蛋白诱导表达条件优化，获得了诱导最佳温度为25℃，诱导时间为12h。将游离细胞与固定化细胞分别与3-羟基丙腈反应进行条件的优化，确定了12h内游离细胞最优反应温度为30℃，固定化细胞反应的最优温度为37℃，最优pH均为Tris-HCl(100mM，pH8.0)缓冲液。在30℃、Tris-HCl(100mM，pH8.0)缓冲液条件下进行反应24h，游离细胞可完全催化4.5mol/L(319.5g/L)底物;固定化细胞催化底物最高浓度为7mol/L(497.56g/L)。结果对比发现，固定化细胞对溶液的pH耐受性更广，热稳定性更强，且底物浓度耐受性更高。游离细胞与固定化细胞的分批反应浓度为3mol/L时，戊二醛/聚乙烯亚胺交联固定化细胞在反应70批次后的酶残余活性仍大于50％。将戊二醛/聚乙烯亚胺交联细胞置于蒸馏水反应溶剂中进行分批反应时，74批次后酶的残余活性仍大于70％。将前30批反应液进行分离纯化，最终获得55.42g产品，催化产量为277.1g/g细胞湿菌重，单批次时空产率为36.9g/L/h。 本文进一步探索了以2-氯乙醇为底物，卤醇脱卤酶作为催化剂合成3-羟基丙腈的路线，然而在30℃条件下，通过流加NaCN溶液的方式，仅获得24mM的3-羟基丙腈。