论文部分内容阅读
背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见的并发症,也是最主要死亡原因之一,在我国的发病率呈逐年上升趋势。DN发病机制复杂,目前尚无有效的治疗方案能阻止它的进展。每个患者背后每年都是巨大的花费,因此早期干预糖尿病肾病的发展有利于改善患者的生活质量和减轻社会负担。蛋白尿是DN最突出的临床表现,研究证明足细胞的受损是导致蛋白尿产生的主要原因。甚至有研究者提出DN也可能是一种“足细胞病”[1-2]。我们的前期研究中,在六分之五肾切除模型,也就是局灶节段性肾小球硬化症(Focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)的经典模型,我们发现足细胞数目的减少,检测到壁层上皮细胞(parietal epithelial cells,PECs)表达足细胞标志物,而且在多处毛细血管袢处均发现足细胞标志物和PECs标志物的双阳性表达。提示存在PECs向足细胞转分化的现象,这种转分化可能参与了足细胞的损伤后修复。足细胞是一种终末期分化的细胞,很难通过增殖补充,一旦损伤就无法再生。越来越多的研究发现,足细胞可以从其他来源再生,在足细胞损伤修复过程中发挥着至关重要的作用。与肾小球上皮细胞所不同的是,PECs具有潜在的增殖能力。更有学者提出PECs可能充当了足细胞的祖细胞,从而替代修复受损的足细胞,参与了足细胞的损伤修复过程。Dr.Romagmani和Dr.Moeller在电镜下观察到PECs向足细胞转分化的过程[3-7],提示了PECs具有转分化成足细胞的可能,进而修复受损的足细胞。那么在足细胞损伤修复的过程中,有哪些因素影响了这一过程呢?最新研究发现人微小RNA(microRNA,miR)中miR-193a表达被下调后可介导PECs高表达WT1等足细胞标志蛋白,促进其向足细胞转分化[8]。miR-193a在成熟的PECs中特异表达,其水平失调可诱导发生一系列分子级联反应,最终可在小鼠和人类中导致肾小球损伤和FSGS[9]。在前期关于PECs向足细胞转分化过程的研究中,我们还发现氯沙坦(RAS抑制剂,ARB)干预组存在较多的PECs向足细胞转分化现象。提示ARB组可能通过促进PECs-足细胞转分化修复受损的足细胞,进而保护足细胞。那么ARB促进足细胞损伤修复的过程中是否是通过调控miR-193a来实现呢?为此,我们提出假说:在糖尿病肾病时ARB可抑制miR-193a的表达,从而促进足细胞的损伤修复。目的:观察miR-193a在早期糖尿病肾病足细胞损伤修复过程中发挥的作用,以miR-193a为新视点为延缓糖尿病肾病进展提供新的思路。方法:随机将5周龄的40只db/db小鼠随机编号分为2组:db/db组和db/db-氯沙坦治疗组(db/db-ARB组),db/m小鼠20只作为正常对照组。经检疫及适应性饲养1周,从6周龄起每隔四周测定各组小鼠的体重和尾静脉血糖,并用代谢笼收集24小时尿。于10周龄时分别作如下药物干预:db/db-ARB组给予ARB Losantan 10mg/(kg·d);db/m组和db/db组给予等量的饮用水,各组小鼠灌胃给药,分别于用药前(10周龄)、用药后4周(14周龄)、8周(18周龄)、12周(22周龄)时分批取肾活检,留取肾组织,制备病理切片,观察肾组织的病理改变;免疫组化检测WT-1的表达变化;免疫荧光检测肾小球中synaptopodin的表达;Western Blotting检测肾组织足细胞标志物WT-1、synaptopodin和壁层上皮细胞标志物claudin1、Pax-2的蛋白表达;提取总RNA,实时荧光定量PCR检测肾组织WT-1、synaptopodin、claudin1、Pax-2的m RNA的表达变化及miR-193a的表达量。结果:1.随着周龄的增加,db/db小鼠体重、血糖、尿蛋白及血肌酐与db/m小鼠相比均明显升高(P<0.05),而给予氯沙坦药物干预后尿蛋白、血肌酐水平较未用药组有所降低(P<0.05)。2.在本实验过程中,与db/m小鼠相比,db/db小鼠始终维持着高血糖,且氯沙坦治疗组与未用药组db/db小鼠的血糖水平无显著性差异(P>0.05)。3.随着周龄的增加,db/db、db/db-ARB小鼠肾组织中足细胞标志物WT-1、synaptopodin的蛋白及m RNA较同周龄的db/m小鼠表达减少(P<0.05),而壁层上皮细胞标志物claudin1、Pax-2的蛋白及m RNA较同周龄的db/m小鼠表达增多(P<0.05);给予氯沙坦治疗后,足细胞标志物WT-1、synaptopodin的蛋白及m RNA较未用药组表达增多(P<0.05),而壁层上皮细胞标志物claudin1、Pax-2的蛋白及m RNA较未用药组表达有所下降(P<0.05)。说明了ARB对糖尿病肾病小鼠的足细胞和肾脏损伤具有保护作用。4.随着糖尿病肾病的进展,db/db小鼠出现肾小球基底膜增厚,系膜细胞及系膜基质增多,肾小管及间质纤维化。给予氯沙坦治疗后以上病理改变有所减轻。5.免疫组化结果提示:随着周龄的增加,db/db小鼠、db/db-ARB小鼠肾组织中WT-1的阳性细胞数较db/m小鼠减少(P<0.05),而给予氯沙坦治疗后,db/db-ARB小鼠肾组织中WT-1的阳性细胞数较db/db小鼠增多(P<0.05)。6.免疫荧光显示:随着周龄的增加,db/db小鼠、db/db-ARB小鼠肾小球中synaptopodin的表达量较db/m小鼠减少,给予ARB治疗后,db/db-ARB小鼠synaptopodin的表达量较db/m小鼠增多。7.实时荧光定量PCR显示,给予氯沙坦治疗后,db/db-ARB小鼠miR-193a的表达量较db/db小鼠明显下降(P<0.05),提示ARB可能抑制了miR-193a的表达。结论:ARB可能抑制了miR-193a的表达,从而促进早期糖尿病肾病小鼠足细胞损伤修复,进而保护受损的足细胞,延缓糖尿病肾病的发展。