【摘 要】
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[目 的]研究植物乳杆菌上清液（Cell-free supernatant,CFS）对大肠杆菌浮游生长、运动能力和生物膜形成的影响,探讨其抑制大肠杆菌生物膜形成分子机制,为防治生物材料相关的生物膜感染提供实验依据。[方 法]本研究分为两部分:1.不同浓度的植物乳杆菌CICC6257上清液与大肠杆菌培养24h,通过微量肉汤稀释法测定植物乳杆菌CICC6257上清液的最低抑菌浓度（Minimum in
【基金项目】
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国家自然科学基金（81960335）； 云南省教育厅科学研究基金（2019Y0362）；
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[目 的]研究植物乳杆菌上清液（Cell-free supernatant,CFS）对大肠杆菌浮游生长、运动能力和生物膜形成的影响,探讨其抑制大肠杆菌生物膜形成分子机制,为防治生物材料相关的生物膜感染提供实验依据。[方 法]本研究分为两部分:1.不同浓度的植物乳杆菌CICC6257上清液与大肠杆菌培养24h,通过微量肉汤稀释法测定植物乳杆菌CICC6257上清液的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）;最低抑菌浓度的植物乳杆菌CICC6257上清液与大肠杆菌培养24h,测定其对大肠杆菌生长曲线的影响;亚抑菌浓度的植物乳杆菌CICC6257上清液与大肠杆菌培养12h,测量半固体培养基上大肠杆菌的运动直径;亚抑菌浓度的植物乳杆菌CICC6257上清液与大肠杆菌分别培养4h、8h、12h和24h,通过XTT法测定不同时间点的细菌活力;亚抑菌浓度的植物乳杆菌CICC6257上清液与大肠杆菌和聚氯乙烯（Polyvinyl chloride,PVC）培养24h,结晶紫半定量法测定其对生物材料表面大肠杆菌生物膜的抑制率和成熟生物膜的清除率;激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）检测生物膜中活死菌分布;扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）观察生物材料表面大肠杆菌生物膜的微观结构。2.基于全转录组测序方法检测植物乳杆菌CICC6257上清液处理与未处理组的大肠杆菌生物膜中差异基因的表达;对差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析;qRT-PCR验证与生物膜形成相关基因的表达情况。[结 果]1.植物乳杆菌CICC6257上清液对聚氯乙烯表面大肠杆菌生物膜形成的影响:①大肠杆菌ATCC25922和尿源性大肠杆菌的MIC均为20%（v/v）。②最低抑菌浓度的植物乳杆菌CICC6257上清液可以降低两株大肠杆菌的最大生长速率和最大菌群密度。③亚抑菌浓度（1/4MIC、1/2MIC、MIC）的植物乳杆菌CICC6257上清液可以降低大肠杆菌的运动能力（P＜0.05）。④随着时间的增长,大肠杆菌的活力逐渐增强,12h时活力最高,之后逐渐下降。在4h时,1/4MIC、1/2MIC和MIC组细菌活力均低于对照组（P＜0.05）。8h和12h时,MIC组细菌活力均低于对照组（P＜0.05）。⑤2MIC组和MIC组对ATCC25922和尿源性大肠杆菌的抑制率分别为84.99%和85.30%、82.78%和82.64%,相较于1/4MIC和1/2MIC组具有较好的生物膜抑制能力（P＜0.05）。⑥MIC组对于ATCC25922和尿源性大肠杆菌生物膜清除率分别为71.6%、66.6%,相较于1/4MIC和1/2MIC组,清除生物膜的能力更强（P＜0.05）。⑦CLSM观察到相较于1/4MIC和1/2MIC组,MIC组活菌数量明显减少,未见明显的生物膜形成。⑧SEM显示MIC组相较于1/4MIC和1/2MIC组,细菌之间连接不紧密,胞外物质分泌相对减少,生物膜较疏松。2.植物乳杆菌CICC6257上清液对大肠杆菌生物膜形成的分子机制:①通过转录组测序,共检出3648个显著差异基因,其中1129个基因上调,2159个基因下调。②GO富集分析显示差异基因主要参与的生物学过程包括细菌Ⅰ型鞭毛基体、细胞壁、核糖体等细胞组成;金属离子结合、转移酶活性和连接酶活性等分子功能;碳水化合物代谢过程、多糖生物合成过程、有机物代谢过程等生物学途径。KEGG通路富集显示差异基因主要与鞭毛装配、细菌分泌系统、脂多糖合成、细菌趋化性等通路相关。③qRT-PCR验证了 motA、motB、flgB、ydiM、nanC、mdtO共6个基因,其表达趋势与测序结果一致。[结 论]1.植物乳杆菌上清液抑制大肠杆菌的运动能力,减少胞外物质的分泌,抑制大肠杆菌生物膜的形成,并对成熟大肠杆菌生物膜具有一定的清除能力。2.植物乳杆菌上清液通过下调motA、motB、flgB来抑制鞭毛运动以及下调ydiM、nanC减少胞外物质的分泌,从而抑制生物膜的形成。
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