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神经病理性疼痛（Neuropathic Pain, NPP）是由躯体感觉系统损伤或病变引起的疼痛综合症，以自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏为特征。NPP发病率高，困扰着数以千万计的患者。NPP疼痛剧烈，药物治疗是其主要治疗手段，但目前临床上治疗药物疗效不佳、毒副作用大，亟待研发具有新治疗靶标与作用途径的新型防治药物。从药用植物中寻找抗NPP活性成分并深入进行相关的关键科技问题探索研究是创制新型抗NPP药物的重要途径。钩吻（Gelsemium elegans Benth）为马钱科植物胡蔓藤的全草，是历史悠久的药用植物。国产钩吻的主要有效成分为吲哚类生物碱，其中钩吻素子（koumine, KM）为其含量最高且毒性较低的一种有效成分，属于单萜吲哚生物碱，分子式C20H22N2O，分子量为306.3。大小鼠坐骨神经慢性束缚损伤（chronic constriction injury, CCI）模型和脊神经结扎（spinal nerveligation, SNL）模型为公认的经典外周NPP动物模型。本课题组新近在大鼠CCI模型和大鼠SNL模型上，以热辐射痛阈、机械刺激痛阈和自发性痛行为为指标，首次观察到钩吻素子具有显著的抗NPP作用，有效剂量远低于中毒剂量，因此钩吻素子可能具有治疗NPP的应用价值。然而，钩吻素子抗NPP作用的机制有待于探索。外周NPP的发生机制包括外周机制和中枢机制，其中脊髓背角是外周NPP的重要调控部位。近年来日益重视神经活性甾体在NPP发生中的调控作用。别孕烯醇酮（allopregnanolone），又称3α,5α-四氢孕酮（3α,5α-tetrahydroprogesterone，3α,5α-THP），是一种重要的神经活性甾体。有文献报道，上调脊髓3α,5α-THP可产生显著的镇痛作用，脊髓3α,5α-THP可能是NPP的重要调控分子。相关研究资料提示，钩吻素子抗NPP作用与脊髓3α,5α-THP可能有关，但其关联规律有待于探索。鉴此，本文拟在大鼠CCI模型上，采用多学科技术手段，探讨钩吻素子抗NPP作用与其调控脊髓别孕烯醇酮水平的关系，探求其作用的关键效应分子；进而深入探索钩吻素子抗NPP作用与其调节脊髓别孕烯醇酮合成关键酶3α-羟化类固醇脱氢酶的关联规律，明确其作用的靶标，以期阐释钩吻素子抗NPP作用的脊髓分子机制，为防治NPP新药研发提供新的药物作用靶点与作用途径，并有助于深化理解NPP的中枢机制；也为提出钩吻素子抗NPP新功效奠定理论基础。具体研究内容如下：1.钩吻素子抗CCI大鼠神经病理性疼痛的作用在大鼠坐骨神经慢性结扎损伤（Chronic constriction injury，CCI）所致的神经病理性疼痛模型上，探讨钩吻素子对CCI大鼠热辐射痛阈和机械刺激痛阈的影响。将基础痛域阈合格的动物随机分成假手术（Sham），CCI模型组，CCI+钩吻素子(7mg·kg-1、1.4mg·kg-1和0.28mg·kg-1)三3个剂量组及CCI+加巴喷丁(40mg·kg-1)组。分别测定大鼠左右两侧足底对热辐射和机械刺激的缩足反应时间（TWL和MWL），术后测定时间为术后第3天，、第5天，、第7天，、第9天。术后第3天开始，假手术组和CCI模型组大鼠皮下注射生理盐水，CCI大鼠给药组大鼠皮下注射对应药物，每天2次，连续7天。实验结果表明，钩吻素子具有显著的抗CCI大鼠热辐射痛敏与机械刺激痛觉超敏的作用，镇痛效应呈剂量和时间依赖性；钩吻素子(7mg·kg-1)给药2天即可显示镇痛作用，并且在给药后第7天达到最大镇痛作用（%抑制率:热辐射痛抑制率86.2±2.0%和机械刺激痛抑制率81.7±2.3%）。结果提示钩吻素子具有较强的抗NPP作用。2.钩吻素子慢性给药对CCI所致神经痛大鼠脊髓腰段脊髓别孕烯醇酮水平的影响。在大鼠CCI术后神经病理性疼痛模型基础上，钩吻素子治疗连续给药7天后，观察大鼠脊髓腰段（L5-6）别孕烯酮醇（3α,5α-THP）变化。实验动物分为假手术组（Sham）、CCI模型组和CCI+钩吻素子(7mg·kg-1、1.4mg·kg-1和0.28mg·kg-1)三3个剂量组。结果显示钩吻素子发挥显著的抗神经病理性疼痛效应同时，可显著提高CCI模型大鼠腰段脊髓别孕烯醇酮的水平，作用呈剂量依赖性，表明钩吻素子抗NPP神经病理性疼痛作用与其提高腰段脊髓内神经活性甾体别孕烯醇酮的水平有关，提示后者可能是钩吻素子抗NPP作用相关的关键效应分子。上述研究表明，钩吻素子能治疗CCI所致的外周神经病理性疼痛，并且能够剂量依赖地提高CCI大鼠腰段脊髓别孕烯醇酮的水平。别孕烯醇酮合成关键酶3α-羟化类固醇脱氢酶（3α-HSD）催化5α-二氢孕酮直接生成3α,5α-四氢孕酮。为了明确钩吻素子提高CCI大鼠腰段脊髓别孕烯醇酮的机制，下述从脊髓3α-HSD结构（酶表达）与功能（酶活性）角度，深入探讨钩吻素子抗NPP作用与其调节脊髓背角3α-HSD的可能关联规律。3.钩吻素子对CCI大鼠术后神经病理性疼痛过程中脊髓背角3α-HSD酶表达的影响通过荧光免疫组化技术动态观察CCI大鼠钩吻素子治疗后3α-HSD酶脊髓表达的变化。实验动物随机分为空白对照组（Na ve）、假手术组（Sham）、CCI模型组、CCI+钩吻素子高剂量(7mg·kg-1)组、CCI+钩吻素子低剂量（0.28mg·kg-1）组。各组动物（除Naive组）于术后第3天开始给药，给药体积给药体积为0.25mL/100g，Sham组、CCI组每天2次皮下注射生理盐水；CCI+钩吻素子高剂量(7mg·kg-1)组、CCI+钩吻素子低剂量(0.28mg·kg-1)组每天2次皮下注射钩吻素子。各组分别于术后第4天、第6天、第9天上午给药后1h以及术后第13天大鼠断头处死，取腰5-6段脊髓进行3α-HSD酶荧光免疫组化。结果显示，CCI组大鼠术侧脊髓背角3α-HSD酶荧光染色强度在术后有逐天上升的趋势，术后第6、9和13天其3α-HSD酶荧光免疫染色显著增强；CCI术后第9天（给药第7天），钩吻素子可显著增强CCI大鼠脊髓背角3α-HSD酶荧光免疫染色强度，作用随剂量增大而增强。3α-HSD酶在脊髓背角分布广泛，可在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞表达分布。4.钩吻素子对CCI大鼠术后神经病理性疼痛过程中脊髓背角3α-HSD酶基因表达的影响采取Realtime-PCR方法动态研究CCI大鼠术后钩吻素子治疗后腰段脊髓3α-HSD mRNA表达水平随术后时间的变化情况。同上分组，实施药物干预、取材；提取脊髓RNA，测定RNA的完整性和浓度；采用Realtime-PCR研究钩吻素子对CCI大鼠腰段脊髓别孕烯醇酮合成酶3α-HSD mRNA水平的影响。结果表明，CCI组大鼠脊髓内3α-HSD mRNA水平在术后有逐天上升的趋势，术后第6、9和13天其水平显著上升；术后第9、13天，钩吻素子可显著提高CCI大鼠脊髓内3α-HSD mRNA水平，作用随剂量增大而增强。上述结果提示，钩吻素子可能通过增强CCI大鼠腰段脊髓3α-HSD mRNA表达从而提高3α-HSD酶蛋白的水平。5.钩吻素子对CCI大鼠术后神经病理性疼痛过程中脊髓3α-HSD酶活性的影响利用3α-HSD酶动力学法，观察钩吻素子对CCI大鼠术后神经病理性疼痛过程中脊髓3α-HSD酶活性的影响。实验分为空白对照组（na ve）、假手术组（sham）、CCI模型组、CCI+钩吻素子7mg·kg-1和0.28mg·kg-1剂量组。术后第3天开始，假手术组和CCI模型组大鼠皮下注射生理盐水，给药组大鼠皮下注射对应剂量的钩吻素子，每天2次，连续7天。于第7天给药后1h，大鼠断头迅速取出腰5-6段脊髓，在组织酶液提取后进行酶活性分析。结果表明，CCI模型大鼠3α-HSD酶活性显著提高，钩吻素子可显著提高CCI大鼠脊髓内3α-HSD酶活性，作用随剂量增大而增强。6.醋酸甲羟孕酮（MPA）对钩吻素子抗CCI大鼠术后机械痛敏作用的影响在CCI大鼠模型上，观察脊髓蛛网膜下腔注射3α,5α-四氢孕酮合成关键酶3α-羟化类固醇脱氢酶的抑制剂醋酸甲羟孕酮（MPA）对钩吻素子抗神经病理性疼痛作用的影响。大鼠行蛛网膜下腔置管术，术后2-3天蛛网膜下腔注射利多卡因鉴定置管术是否成功。置管术成功的大鼠恢复适应后，进行CCI手术。以机械刺激痛阈为指标筛选CCI痛敏大鼠。将CCI痛敏大鼠随机分为DMSO+NS组、MPA(1.25mg·kg-1)+NS组、DMSO+KM组、MPA(0.25mg·kg-1)+KM组、MPA(0.5mg·kg-1)+KM组和MPA(1.25mg·kg-1)+KM组。CCI术后第9天，不同组分别蛛网膜下腔注射溶媒DMSO或不同剂量MPA，0.5h后皮下注射钩吻素子(7mg·kg-1)或生理盐水，再过1小时测量大鼠机械刺激缩足潜伏期。结果显示，外周皮下注射给予钩吻素子可显著对抗CCI大鼠机械刺激痛觉超敏，而脊髓蛛网膜下腔注射给予MPA可剂量依赖性翻转外周皮下注射给予钩吻素子的抗CCI大鼠机械刺激痛觉超敏的作用，但脊髓蛛网膜下腔注射MPA本身对CCI大鼠机械刺激痛觉超敏作用没有显著影响，提示钩吻素子抗神经病理性疼痛作用可能与其上调脊髓3α-羟化类固醇脱氢酶酶活性有关。综上，钩吻素子可能通过增强脊髓背角3α-羟化类固醇脱氢酶，包括酶表达与酶活性，进而上调3α,5α-四氢孕酮水平从而发挥抗神经病理性疼痛作用，3α-羟化类固醇脱氢酶可能是钩吻素子调控脊髓背角3α,5α-四氢孕酮水平的重要作用靶点。