背景：缺血性脑血管疾病是常见的病理过程，严重影响着人类的健康和生命，对其发病机制的研究及积极寻找有效药物显得尤为重要。众所周知，溶栓及脑保护治疗仍然是治疗缺血性脑血管疾病的两大趋势，而中药及其有效成分在缺血性脑血管病治疗中的作用正逐渐受到重视。丹皮酚（Paeonol，Pae）又称牡丹酚，是毛茛科植物牡丹（Paeonia Suffruticosa Andr）根皮和萝摩科植物徐长卿[nostelma Paniculatum（Bunge）K．Schum]干燥根或全草的主要有效成分。作为传统中药的有效单体成分，大量实验研究已表明丹皮酚具有镇静、催眠、解热、镇痛、抗炎、抗菌等药理作用，通过本研究观察丹皮酚是否具有脑保护作用及具体机制。现代医学研究认为脑缺血再灌注损伤是大多数缺血性脑血管疾病的主要病理生理过程，其发生机制涉及到自由基、兴奋性氨基酸、钙超载、能量耗竭等多个问题。1956年，美国学者Harman首先提出了自由基损伤的理论。认为需氧细胞代谢过程中产生的超氧自由基具有毒害效应，可造成生物损害和衰老。脑缺血发作时，脑细胞生物氧化功能发生异常，产生大量自由基。自由基扩散进入血液，氧化损伤组织、细胞和生物分子，产生大量的脂质过氧化物，其中最主要的是MDA。自由基氧化损伤血管内皮细胞、毛细血管基底膜和脑细胞，造成毛细血管通透性增高和细胞功能障碍。SOD是主要的抗氧化酶之一，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，阻断自由基的毒性作用。因此，氧自由基引发的脂质过氧化反应是缺血再灌注损伤的重要机制之一。目前研究发现，NO参与缺血性脑血管疾病的整个病理生理过程。病理状态下NO本身也是一种自由基，可造成膜脂质过氧化，还可与超氧自由基反应生成具有强氧化作用的氧化亚硝酸离子，后者直接氧化脂质，DNA及蛋白质巯基、锌硫中心、铁硫中心，造成细胞致死性氧化损伤。NO参与缺血性脑血管疾病表现为双重作用，这主要由NOS所决定，体内NO的生物作用完全依赖于NOS的活性。NOS分为神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）和诱生型NOS（iNOS）。神经元型和内皮型在生理状态下即有表达并需有钙离子参与，诱生型只在病理状态下表达，其表达为非钙依赖性。缺血再灌早期eNOS产生的NO可扩张血管，抑制血小板聚集和白细胞粘附及抑制NMDA受体，表现为有益的作用。随缺血再灌时间延长iNOS开始表达且和nNOS一同缓慢而持久地大量产生NO表现为有害的作用。目前兴奋性氨基酸毒性学说受到了越来越多的关注。其他学说都与它有着不同的联系。兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）包括谷氨酸、天门冬氨酸等。与缺血性脑损害有关的兴奋性氨基酸主要为谷氨酸。脑缺血后，氧和血糖供应不足，能量生成减少，导致神经元和神经胶质细胞去极化。突触前膜电压依赖性Ca²⁺离子通道开放，谷氨酸释放到突触间隙。另外，突触前膜由于能量缺乏，对谷氨酸的重摄取受到抑制，进一步增加细胞外谷氨酸的堆积。谷氨酸刺激N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体过度兴奋，NMDA受体不仅是兴奋性氨基酸的特异性受体和兴奋毒性的主要神经通路，还作为配体门控性Ca²⁺通道导致Ca²⁺大量内流，激活Ca²⁺依赖性蛋白酶，此外大量内流的Ca²⁺与CaM结合，受到Ca²⁺+2CaM直接调节的NOS被大量激活，导致合成过量的NO，最终引起细胞骨架破坏、自由基损伤、离子平衡紊乱等，即“血供中止→无底物→无能量→细胞死亡”。在脑缺血过程中，兴奋性氨基酸的神经毒性作用是损伤脑组织的启动者和执行者。EAA必须通过激活突触后膜兴奋性氨基酸受体起作用，因此，兴奋毒性的核心是兴奋性氨基酸受体的激活。NMDA受体的磷酸化是离子通道功能调节的一种重要机制，NMDA受体由NR1、NR2（2A-2D）和NR3（A，B）亚基异聚体组成。NR1是受体通道的功能部分，NR2具有调节受体通道动力学作用，且其酪氨酸残基可被磷酸化。目的：大量实验研究已表明丹皮酚能够显著减少缺血再灌注大鼠的梗死面积，减少脑内炎症细胞、黏附分子等作用。但以往实验多采用在体急性缺血损伤模型来观察细胞形态改变和研究损伤机制，本研究通过采用大鼠神经元原代离体培养，排除活体状态下内分泌、循环、体液等多种因素的影响，研究丹皮酚是否对脑内单个神经元有直接保护作用及其发挥作用的具体机制。本实验选用大鼠的海马神经元作为研究对象，旨在动态观察具有NMDA受体的细胞受缺血缺氧的影响、其NMDA受体的变化和丹皮酚对其本身离子通道的影响。本实验通过动态测定缺糖缺氧再灌注损伤海马神经元存活率、NMDA受体结合力及其NR1亚基mRNA表达、细胞外液兴奋性氨基酸含量和神经细胞内游离Ca²⁺含量的改变；观察SOD、MDA及NO含量和NOS活性变化，研究脑缺血缺氧后不同时间点各项指标的变化及丹皮酚的作用，探讨丹皮酚发挥脑保护作用的时间窗及具体作用机制，为研究开发丹皮酚提供实验依据。方法：1．选取72h内Wistar新生大鼠，雌雄不限，75％乙醇消毒后，剥离头皮及颅骨，取出完整脑组织，钝性分离海马，原代培养大鼠海马神经元。2．根据再灌注不同时间及药物不同浓度将神经元随机分4大组：①对照组（control）：正常换液培养；②模型组：原代神经元缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation，OGD）再灌注损伤组：神经元于培养第8d建立模型，制备模型前以平衡盐缓冲液冲洗数次，使葡萄糖终浓度小于1mmol·L^-1。每孔加入100μl无糖Hank’s液，并放入缺氧盒内，持续缓慢通入含有100％N₂的混合气体2.5h，取出并吸弃平衡盐缓冲液，换以完全培养基孵育，置入CO₂培养箱，分别孵育6h、12h、24h；③药物处理组：换以无糖Hank’s液建立OGD再灌损伤模型，在每个再灌注时间点前分别加入高(5μmol·L^-1，Pae-H)、中(1μmol·L^-1，Pae-M)、低(0.2μmol·L^-1，Pae-L)三个浓度丹皮酚；④MK-801对照组：换以无糖Hank’s液建立OGD再灌损伤模型，在每个再灌注时间点前加入MK-801(10μmol·L^-1)。3．每组细胞均在倒置相差显微镜下动态观察低糖低氧再灌注不同时间一般形态学变化，MTT检测不同时间神经元活性，试剂盒测定SOD、MDA、NO含量及NOS活性，放射配基结合实验测定NMDA受体结合力，PT-PCR半定量检测NMDA受体NR1亚基mRNA的表达，氨基酸分析仪测定谷氨酸含量，荧光分光光度计测定神经元内游离Ca²⁺含量。结果：1．通过本实验研究发现，经丹皮酚处理神经元形态改变减轻，且MTT结果显示丹皮酚可明显提高神经元存活率，MK-801(10μmol·L^-1)有相同作用；2．数据结果显示模型组MDA、NO量及NOS活性均明显比正常组高且随再灌时间的延长而逐渐增高而SOD含量明显下降，丹皮酚组所测得的MDA、NO量及NOS活性明显比模型组低，SOD量显著升高，上述几项指标结果表明丹皮酚具有确切直接抗氧化作用从而发挥脑保护作用；3．实验结果又显示各浓度丹皮酚及MK-801均能降低再灌注各时间点谷氨酸含量；丹皮酚组NMDA受体结合力即与谷氨酸相结合亲和力及活性均比损伤组降低，疗效优于MK-801；RT-PCR结果显示各浓度丹皮酚及MK-801在各个再灌注时间点均降低NR1亚基mRNA表达；荧光检测结果提示丹皮酚可降低神经细胞内Ca²⁺浓度，MK-801亦有相同作用，此几项指标显示丹皮酚通过作用于NMDA受体及谷氨酸而抑制了兴奋性氨基酸毒性通路从而发挥脑保护作用。结论：所有指标显示高中低三个浓度丹皮酚均有确切脑保护作用，尤其是高浓度丹皮酚。因抗氧化作用与兴奋性氨基酸毒性作用通过NMDA受体相互间密联系，所以丹皮酚不仅通过抑制兴奋性氨基酸毒性通路而阻止此后一系列的如氧自由基的损伤而发挥脑保护作用，且可直接作用于自由基通过抗氧化而发挥脑保护作用。综上所述，丹皮酚发挥脑保护作用涉及多个方面多个领域。丹皮酚作为具有多种理活性的传统中药，近年来逐渐引起了医药界的重视，尤其在心脑血管疾病和肿瘤疾病方面显示出良好的药理活性，希望本次研究能够为其在临床应用研究及新剂型的开发提供一定的帮助。