磷具有多种生理功能,其代谢平衡可以保证机体多项生理功能得以正常进行,磷代谢失衡可由多种遗传代谢性疾病直接导致,同时也是多系统临床疾病的重要并发症之一。磷在肾近曲小管刷状缘顶端细胞的跨膜转运过程是其代谢的限速步骤及调控的主要部位。此限速步骤过程是由Ⅱ型钠磷协同转运子（type Ⅱ sodium-dependent Pi cotransporter,Npt2）辅助转运完成的。目前发现与肾脏磷转运相关的主要有Npt2a和Npt2c两种,它们特异性地表达于肾脏近曲小管刷状缘上皮细胞,利用细胞内外钠离子浓度差所产生的势能作为动力,将磷酸盐逆浓度梯度跨膜转运至细胞内,完成磷酸盐在肾脏近曲小管的重吸收过程,因此Npt2是体内磷代谢平衡的关键因子。磷代谢调控机制尚不明确,因此磷代谢紊乱相关性疾病缺乏特异性治疗。既往观点认为1,2-二羟维生素D3（1,25（OH）2D）和甲状旁腺激素（PTH）是最为重要的调节磷代谢的因子,但是目前越来越多的研究证实成纤维生长因子23（fibroblast growth factor 23,FGF23）水平异常是磷代谢相关疾病发生、发展及预后的独立危险因素。课题前期研究证实Npt2基因突变会导致严重磷代谢紊乱,其中在小鼠体内Npt2a起主导作用,而在人体,主要是Npt2c起主导作用,具体原因尚不清楚,可能跟种属差异性相关。本研究在前期研究的基础上,建立基因敲除鼠模型,通过特殊饮食诱导与体内血磷、血钙及尿磷、尿钙等水平发生变化,进一步检测与磷代谢及调控的生化指标、关键因子及肾脏矿化程度等相应的变化来进一步研究磷代谢及其调控的具体机制。本研究主要包括两个部分:第一部分通过对临床患者基因测序及分析寻找新的可导致遗传性低磷性佝偻病合并高尿钙症（Hereditary Hypophosphatemic Rickets with Hypercalciuria,HHRH）疾病发生的Npt2致病突变;研究HHRH患者可能存在与既往报道所不同的新的症状及风险,从而为优化现有治疗方案和寻求新的治疗方案提供理论依据。第二部分通过建立Npt2a基因敲除动物模型,并用不同的饮食进行干预,检测与磷代谢及调控相关的生化指标及关键因子水平及肾脏矿化程度的变化,进一步研究由不同钙磷含量饮食所引起的不同血钙磷浓度及尿磷、尿钙排泄指数对磷代谢过程及与之相关的调节因子的作用。同时观察肾脏矿化程度的变化,研究HHRH患者肾脏矿化的预测因子。总之通过本研究可能够进一步明确磷代谢和调节的相关机制和关键因子,为临床上表现为磷代谢紊乱相关疾病寻找新的致病突变,优化现有治疗并寻求新的治疗方案。研究目的编码Npt2的等位基因溶质载体家族34成员3（solute carrier family 34,member 3,SLC34A3）复合杂合和纯合（comp/hom）失活突变可导致一种常染色体隐性遗传性疾病HHRH的发生。HHRH是一种以肾脏磷排泄增多为特征的疾病,导致低磷酸盐血症,引起继发性的1,25（OH）2维生素D（1,25（OH）2D）水平升高,高钙尿和佝偻病/骨软化。本研究对5个以前从未报道的HHRH的家系及其成员进行基因测序及分析,寻找新的致病基因突变;同时对肾脏矿化及与之相关的生化指标进行检测、分析,明确哪些指标是独立于基因型的危险因素,用以指导今后的治疗并预防肾脏矿化和肾脏潜在CKD的发生。研究对象和方法1、研究对象:本研究选取2013年1月至2015年12月在哈佛医学院附属麻省总院内分泌门诊及病房住院筛选出的5例新诊断的HHRH患者及其家系成员作为研究对象（由于保密协议签订,患者及其它相关信息暂不能公开）。2、研究方法:对所有患者及家系成员、对照人群进行相关评估。在获得知情书面同意后,对患者及家系成员进行SLC34A3基因组DNA扩增,然后在MGH DNA测序中心进行核苷酸序列分析。实验室检查:用不同检测方法及试剂盒检测25（OH）D水平、1,25（OH）2D水平、血清PTH水平、血清FGF23水平。利用影像学检查（超声或CT）评估肾脏矿化程度。研究结果1、通过对5个新诊断的HHRH患者及其的家系成员的SLC34A3/Npt2c核苷酸序列分析,发现3个新的致病突变。其中一个新的纯合错义突变、一个新的缺失突变和一个新的复合性杂合缺失突变。2、SLC34A3/NPT2c突变的comp/hom携带者肾脏矿化（或肾结石）的患病率显著增高。Npt2c基因突变的复合杂合子携带者发生率高达16%,而Npt2c突变的comp/hom携带者的发生率却高达46%,比其它家系成员发生率显著增加。其中,43例SLC34A3/NPT2c突变的comp/hom携带者中有15例（35%）出现肾结石（P=0.05）,6例（14%）有肾脏矿化。此外,肾脏超声结果显示43名com/hom个体中有13名出现肾脏矿化。3、本研究通过统计分析发现Npt2c突变携带者的平均血清P、TRP和PTH水平降低,而血清Ca、1,25（OH）2D、FGF23水平和尿钙排泄（uCa/uCrea）比率增加。根据单因素方差分析,与携带野生型、杂合子和com/hom时差异显著。几乎所有患者及家系成员早期肾功能均正常;血清1,25（OH）2D、TRP和FGF23水平在限制单变量logistic回归分析时仍然显著升高,因此可以作为HHRH患者发生肾脏矿化甚至肾结石发生的预测因子。研究结论1.在本研究中,我们通过对五个尚未报道的新诊断的HHRH患者及其家系成员的SLC34A3/NPT2c核苷酸序列分析发现了 3个新的致病突变。2.本研究发现肾矿化和肾结石可能是comp/hom SLC34A3/NPT2c突变携带者的一个重要的、通常未被识别的症状。这对于现在已应用于临床治疗HHRH的方案可能存在的潜在风险有很大的提示作用。3.血1,25（OH）2D、血磷、血FGF23水平可作为HHRH患者出现肾矿化和肾结石重要的预测因子。并可指导优化今后HHRH的治疗方案,预防肾脏矿化、肾结石和潜在CKD的发生。研究目的磷在肾近曲小管的重吸收过程是其代谢及调控的限速步骤,前期研究已证实Npt2（2a及2c）基因突变导致肾近曲小管磷的重吸收障碍可引起HHRH。本研究通过建立Npt2a-/-模型,以野生型（WT）小鼠作为对照,用不同钙和磷含量饮食进行干预,通过观察肾矿化程度及磷代谢及调控相关的生化的因子水平的变化,进一步明确饮食与Npt2a-/-小鼠肾脏矿化程度相关的独立危险因素,如果这些因素在患者身上被证实,可指导今后HHRH的治疗并为预防肾脏矿化及肾结石提供有效的预测因子。研究对象和方法1、研究对象:雄性和雌性C57BL/6小鼠购买自马萨诸塞州查尔斯河实验室。雄性和雌性Np t2a-/-小鼠购买自杰克逊实验室。野生型（WT）小鼠和Npt2a-/-小鼠生后8周后被随机分配至各实验组,用特殊饮食饲养至30周。根据所饲料中钙磷含量不同分为:高磷高钙（HPC）饮食组（2.0%Ca,1.25%Pi）;高磷（HP）饮食组（1.2%Pi,0.6%Ca）;对照（CO）饮食组（0.6%Ca,0.3%Pi）。2、研究方法:所有小鼠均行以下检查:分别使用试剂盒测定血清和尿液总钙（Ca）、血清和尿液无机磷（S-P）、尿钠（U-Na）、钾（U-K）、氯化物（U-Cl）、血尿素氮（S-BUN）浓度、尿肌酐（U-crea）浓度、血浆PTH、血清FGF23和血清1,25（OH）2D浓度。计算尿钙和尿磷的排泄指数。通过计算菊粉清除率了解各小鼠肾功能情况。通过肾脏病理学及影像学（超声/CT）观察小鼠肾脏矿化、肾结石情况。研究结果1、高磷饮食可诱导Npt2a-/-小鼠产生肾脏矿化,肾脏钙磷沉积可存在于管腔内和间质内。2、与WT小鼠相比,CO饮食饲养的Npt2a-/-小鼠的血磷、血浆PTH和FGF23降低,而血清1,25（OH）2D和尿钙增加。HP饮食组的Npt2a-/-小鼠尿磷水平增高,同时HPC饮食组Npt2a-/-和WT小鼠尿钙水平均增高。三组特殊饮食均会导致Npt2a-/-小鼠的尿钙磷乘积升高,但WT小鼠尿钙磷乘积却无改变。与HP饮食组相比,HPC饮食组的中的Npt2a-/-磷排泄量没有明显增加,这可能是由于肠道对CaHPO4吸收减少以及饮食中的高钙抑制PTH所致。所有组小鼠血清BUN水平均在正常范围内。3、HPC饮食饲养10周后,Npt2a-/-小鼠（n=12）肾脏矿化面积为0.58±0.08%,CO 组Npt2a-/-小鼠（n=21）的肾脏矿化面积为 0.27±0.18%（p＜0.0001 vs.HPC饲粮,）。HP组Npt2a-/-小鼠肾脏矿化面积为0.23±0.08%（n=23）,比HPC组明显减少,而与CO组肾脏矿化面积相似。HPC组及HP组的WT小鼠中未发现肾脏矿化,但在CO组的10只WT小鼠中有2只观察到矿化,尽管矿化发生率低于相同饮食的Npt2a-/-小鼠,但是矿化程度却基本相同。4、Npt2a-/-小鼠肾脏矿化程度与血磷和FGF23水平以及尿钙排泄指数直接相关。对所有Npt2a-/-小鼠进行联合单变量线性回归分析后显示:尿钙/尿肌酐比率和尿钙排泄指数与矿化面积百分比显著正相关。该分析还显示血磷和血浆FGF23与矿化面积百分比呈正相关。5、多元线性回归分析表明血磷、血清FGF23、尿钙、尿磷是肾脏矿化的独立预测因子。研究结论1、HP/HC饮食可引起Npt2a-/-小鼠肾脏钙磷排泄增多会引起肾脏皮质及髓质部位的钙磷沉积,而WT小鼠却不会发生钙磷沉积。这说明Npt2a-/-小鼠肾脏矿化不仅与基因突变相关,还与血磷水平、血FGF23水平、尿钙排泄指数直接相关。2、Npt2c/Npt2a辅助磷的重吸收过程受多因素调控,其中FGF23为调控的核心因子,不仅与肾脏矿化的严重度呈正相关,而且可作为肾脏矿化的独立预测因子。3、目前临床上用口服补充磷的方法来治疗HHRH患者,这种治疗方案可能存在肾脏矿化甚至肾结石发生的风险,因此,如果在患者治疗过程中得到证实,对今后治疗的优化、甚至制定新的治疗方案有着重要的意义。