血管性痴呆（Vascular dementia,VD）是由各种脑血管疾病（缺血或出血或急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑功能障碍而引起的一组获得性认知功能障碍临床综合征。随着全球人口老龄化时代的到来,脑血管病患病人数逐年增多,VD已成为仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）导致认知功能障碍的第二大病因。迄今为止,VD的发病机制尚未完全明确,治疗方面主要是控制相关的心脑血管危险因素及伴随症状,缺乏确切有效的治疗药物。因此,深入探讨VD的发病机制,并寻求有效的VD防治药物显得尤为重要和迫切。雌激素是一种类固醇激素,不仅影响女性生殖系统,还能调节糖脂代谢、骨代谢,保护心血管系统。脑是雌激素作用的靶器官之一,雌激素受体广泛分布于海马、大脑皮层、下丘脑、基底前脑等与认知相关的区域。流行病学资料显示,脑卒中发病率在绝经前女性中明显低于同年龄阶段男性,但绝经后男女发病率无明显差异。近年研究发现,应用雌激素替代治疗的绝经后女性,其痴呆的发病率明显降低,表明雌激素可能是一种有希望的治疗VD的新方法。在中枢神经系统中,海马是学习记忆、信息处理和信号传输的重要部位,当海马受到缺血缺氧损伤时,细胞内多条信号转导通路出现异常,细胞凋亡及自噬同时激活,从而加速神经元的死亡。Wnt/β-catenin信号通路是一条在中枢神经系统发育过程中发挥重要作用的关键性通路,而且也参与各种细胞内程序,包括细胞增殖、存活、分化、调亡,是调控细胞生长、增殖分化的关键途径。但到目前为止,在血管性痴呆模型中,雌激素能否通过调节海马神经元凋亡、自噬及Wnt/β-catenin信号通路,从而影响VD大鼠学习记忆能力的文献报道很少。基于上述研究背景,本研究选取雌性SD大鼠,采用双侧卵巢切除术（Ovariectomy,OVX）联合双侧颈总动脉结扎术（Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）制备去势VD大鼠模型,应用雌激素连续干预8周,采用Morris水迷宫评估大鼠学习和记忆能力的改善情况,采用HE染色和透射电子显微镜观察雌激素对海马神经元形态学影响,采用免疫组织化学染色和Western blot法观察雌激素对细胞凋亡、自噬相关蛋白的表达影响。在此基础上,进一步探讨雌激素发挥神经保护作用是否与激活Wnt/β-catenin信号转导通路有关,为雌激素改善认知障碍的作用机制提供更全面的理论依据。第一部分 去卵巢血管性痴呆大鼠模型的建立及雌激素对去卵巢血管性痴呆大鼠认知功能的影响目的:通过OVX联合BCCAO的方法,建立去势大鼠VD动物模型,通过行为学评估VD大鼠学习记忆能力,观察雌激素对VD大鼠认知功能的影响。方法:1.清洁级成年健康雌性SD大鼠48只,随机分为假手术组（sham组）、模型组（model组）、雌激素早期治疗组（E2-early组）、雌激素晚期治疗组（E2-later 组）。2.假手术组大鼠仅切除卵巢周围少量脂肪组织,其余三组大鼠予OVX术切除双侧卵巢。OVX术后1周,假手术组大鼠接受BCCAO假手术,其余三组大鼠接受BCCAO制备VD模型。3.E2-early组大鼠于BCCAO术后第一天开始接受17β-雌二醇（E2）腹腔注射,100 μg/kg/day,溶剂为芝麻油;E2-later组大鼠于BCCAO术后一周开始接受E2腹腔注射,100 ug/kg/day;假手术组和模型组大鼠分别接受等量芝麻油腹腔注射。每组大鼠每天腹腔注射一次,连续8周。4.最后一次给药的次日,对大鼠进行Morris水迷宫实验,评估大鼠的空间学习记忆能力。前5天为定位航行实验,第6天为空间探索实验。结果:1.定位航行实验将逃逸潜伏期（escape latency）即SD大鼠从入水到上台的时间,作为评估大鼠空间学习能力的指标。随着训练天数的增加,四组大鼠的平均逃逸潜伏期逐渐缩短,统计学显示同组各时间点逃逸潜伏期具有显著性差异（F=173.481,P<0.01）。在定位航行实验的第1天,四组大鼠的逃逸潜伏期尚无明显差异;在定位航行实验的第2～5天,模型组大鼠逃逸潜伏期较假手术组明显增加（第2天,P<0.05;第3～5天,P<0.01）。雌激素干预后,E2-early组大鼠逃逸潜伏期较模型组明显缩短（第3天和第4天,P<0.05;第5天,P<0.01）。E2-later组仅在第5天逃逸潜伏期较模型组明显缩短（P<0.05）。2.空间探索实验在实验的第6天,撤除平台,记录大鼠120秒内在原平台象限停留时间占总时间的百分比（目标象限时间百分比）、原平台象限路程占总路程的百分比（目标象限路程百分比）以及穿越原平台所在位置的次数（穿台次数）,作为评估大鼠空间记忆能力的指标。模型组大鼠目标象限时间百分比和路程百分比均明显缩短,表明BCCAO导致了大鼠记忆缺陷,而E2-early组大鼠目标象限时间百分比和路程百分比均较模型组明显增多。模型组大鼠穿台次数较假手术组显著减少;E2-early组大鼠穿台次数较模型组明显增加。虽然E2-later组大鼠的目标象限时间百分比、目标象限泳程百分比、穿台次数均高于模型组,但差异无统计学意义。3.四组大鼠游泳轨迹的变化大鼠初入水时随机游动寻找水下平台,游泳轨迹多在水迷宫边缘。随着训练天数增加,假手术组、雌激素治疗组大鼠寻台方式逐渐变为趋向式,尤其是假手术组大鼠的游泳轨迹甚至接近直线模式,而模型组大鼠直至训练结束,寻台方式仍多为边缘模式,反映出模型组大鼠出现了明显的认知功能损害。结论:1.通过OVX联合BCCAO方法能够成功建立去势VD大鼠模型,能模拟慢性脑低灌注造成的学习及记忆功能障碍。2.雌激素治疗可以明显改善VD大鼠的学习和记忆能力,并且早期雌激素干预比晚期雌激素干预更有效。第二部分 雌激素对血管痴呆性大鼠海马组织形态学的影响目的:观察VD大鼠海马神经元病理形态学的改变以及雌激素不同给药时机对VD大鼠海马神经元形态学的影响。方法:行为学测试结束后,大鼠麻醉,心脏采血,采用ELISA法测定各组大鼠血清雌二醇数值。灌注固定,断头取脑,制备标本,光镜下HE染色和透射电镜观察海马CA1区神经元细胞形态学变化。结果:1.血清雌二醇浓度的测定结果模型组大鼠血清中雌激素的浓度较假手术组和雌激素治疗组均显著降低。雌激素治疗组和假手术组比较,血清中雌激素的浓度差异无统计学意义。2.大鼠海马CA1区神经元HE染色结果假手术组大鼠海马CA1区椎体神经元细胞数量丰富,排列紧密,细胞轮廓清晰,形状规则饱满,核仁清晰,染色质分布均匀。模型组大鼠海马CA1区椎体神经元排列松散紊乱,胞体缩小,大部分胞体呈多角形或梭形,细胞核固缩深染,核仁模糊甚至完全消失,胞浆周围空晕。经雌激素治疗后的大鼠,尤其是E2-early组,海马CA1区椎体神经元细胞损伤较轻,细胞排列相对致密,细胞结构相对完整,核仁清晰,偶见核固缩的神经元。E2-later组海马CA1区神经元细胞数量减少,排列较为松散,多数细胞形态模糊,可见少部分核固缩变性的神经元。3.大鼠海马CA1区神经元超微结构改变假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态规则饱满,双层膜结构清晰,核内染色质分布均匀,胞浆内细胞器丰富,超微结构完整,只有少量神经元内可见自噬小体。模型组大鼠海马CA1区神经元细胞轮廓异型,核固缩,核周隙变大,核膜溶解内陷,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器明显减少,残存的线粒体肿胀呈空泡样,粗面内质网扩张断裂,自噬小体增多。雌激素干预后,细胞核和细胞器的超微结构损伤明显减轻,细胞核形态正常,细胞器清晰。值得注意的是,与E2-early组相比,E2-later组大鼠海马CA1区神经元的超微结构损伤仍较为明显。结论:VD大鼠的海马CA1区神经元细胞出现了显著的组织病理学变化。经过雌激素治疗后,尤其是早期治疗组,海马神经元的损伤明显减轻,雌激素可能以一种治疗时间依赖的方式发挥其作用。第三部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡和自噬相关蛋白表达的影响目的:观察VD大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表达,进一步观察雌激素对神经元凋亡及自噬的调控作用,探讨雌激素发挥神经保护作用的机制。方法:1.动物分组及干预方式同第一部分。2.采用免疫组化的方法检测大鼠海马组织CA1区Bcl-2、Bax、caspase-3、Beclin1阳性细胞的表达,采用免疫荧光染色观察大鼠海马组织中LC3Ⅱ阳性细胞的表达。采用蛋白质免疫印迹技术检测大鼠海马组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1 蛋白的表达变化。结果:1 免疫组化方法检测大鼠海马Bcl-2、Bax、caspase-3、Beclin1的表达变化1.1 光镜下Bcl-2免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,神经元胞浆和胞核均有定位。与假手术组相比,模型组海马CA1区神经元Bcl-2的IOD/area值明显降低（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组Bcl-2的IOD/area值显著增高（P<0.05）,而E2-later组Bcl-2的IOD/area值虽较模型组有增高,但无统计学差异。1.2 光镜下Bax免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,主要定位于神经元胞浆。与假手术组相比,模型组海马CA1区神经元Bax的IOD/area值明显增高（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组Bax的IOD/area值显著降低（P<0.05）,而E2-later组Bax的IOD/area值虽较模型组有所降低,但无统计学差异。1.3 光镜下caspase-3免疫阳性产物为棕色颗粒,神经元胞浆及胞核均有定位。与假手术组相比,模型组海马CA1区caspase-3的IOD/area值明显增高（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组caspase-3的IOD/area值显著降低（P<0.05）,而E2-later组caspase-3的IOD/area值虽较模型组有降低,但无统计学差异。1.4 光镜下Beclin1免疫阳性产物为棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。与假手术组相比,模型组海马CA1区Beclinl的IOD/area值显著增加（P<0.01）。与模型组相比,E2-early 组及 E2-later 组 Beclinl 的 IOD/area 值均显著降低（P<0.01 E2-early组vs.Model组;P<0.05 E2-later组vs.Model组）,但E2-early组与E2-later组之间差异无统计学差异。2 免疫荧光观察大鼠海马LC3Ⅱ的表达LC3Ⅱ蛋白在本实验中标记为黄绿色荧光。荧光显微镜观察假手术组神经元细胞免疫荧光表达较微弱,模型组LC3Ⅱ免疫荧光强度明显增加（P<0.01）。与模型组比较,E2-early组和E2-later组LC3Ⅱ免疫荧光表达强度均显著减少（P<0.01 E2-early 组 vs.Model 组;P<0.05 E2-later组vs.Model组）,但E2-early组与E2-later组之间差异无统计学差异。3 Western blot 结果3.1 模型组大鼠海马中Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclinl蛋白的表达3.1.1 与假手术组相比,模型组Bcl-2蛋白表达量显著下降（P<0.05）,Bax蛋白、caspase-3蛋白表达量均显著升高（均P<0.05）,有统计学意义。3.1.2 与假手术组对比,模型组LC3Ⅱ蛋白及Beclin1蛋白表达量显著升高（均P<0.05）,有统计学意义。3.2 雌激素对 VD 大鼠海马 Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达的影响3.2.1 与模型组相比,E2-early组及E2-later组Bcl-2蛋白表达量均显著增加（均P<0.05）,Bax蛋白表达量均显著下降（均P<0.05）,caspase-3蛋白表达量均显著下降（均P<0.05）,有统计学差异。3.2.2 与模型组相比,E2-early组及E2-later组LC3Ⅱ蛋白表达量显著下降（均P<0.05）,E2-early组及E2-later组Beclin1蛋白表达量明显下降（P<0.01 E2-early组vs.Model组;P<0.05 E2-later 组 vs.Model 组）,有统计学差异。结论:VD大鼠海马神经元细胞凋亡增加及自噬被激活,导致海马神经元变性及死亡。雌激素可以通过减轻海马神经元凋亡及下调自噬的激活来改善海马损伤。第四部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马组织Wnt/β-catenin信号通路的影响目的:观察雌激素对VD大鼠Wnt/β-catenin信号转导通路的影响,并对其分子生物学机制进行探讨。方法:1.清洁级成年健康雌性SD大鼠48只随机分为四组:假手术组（sham组）、模型组（model组）、雌激素组（E2组）、雌激素+Wnt通路抑制剂组（E2+DKK1 组）。2.模型组大鼠仅切除卵巢周围少量脂肪组织,其余三组大鼠予OVX术。OVX术后1周,模型组、E2组、E2+DKK1组接受BCCAO手术制备VD模型,假手术组行BCCAO假手术。E2+DKK1组大鼠于BCCAO术后第一天接受侧脑室置管术。3.E2组大鼠及E2+DKK1组大鼠分别于BCCAO术后第1天开始接受17β-雌二醇腹腔注射,100 μg/kg/day,溶剂为芝麻油,假手术组大鼠和模型组大鼠分别接受等量芝麻油腹腔注射。每日1次,连续7天。重组人类DKK1蛋白用于阻断Wnt/β-catenin信号转导通路。E2+DKK1组大鼠于BCCAO术后第1天和第4天接受侧脑室注射DKK1 10 μl,浓度为1μg/μl。4.BCCAO术后7天后取材,光镜下HE染色及透射电镜观察海马CA1区神经元细胞形态学变化,免疫组化法及Western blot技术检测海马组织中β-catenin、Cyclin D1、GSK-3β 的蛋白表达。结果:1.光镜下大鼠海马CA1区神经元HE染色结果假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列致密有序,胞核规则饱满,核仁清晰。模型组大鼠海马CA1区神经元排列紊乱,胞体缩小呈梭形或多角形,胞核深染、固缩,核仁消失。E2组大鼠海马CA1区神经元损伤明显减轻,神经元排列整齐,大部分细胞形态清晰,少部分神经元细胞形态模糊,偶见核固缩的神经元。E2+DKK1组大鼠海马CA1区神经元排列松散紊乱,大部分神经元细胞形态模糊,胞核形状不规则,深染、固缩,胞浆周围发现空晕,胞间距较大。2.透射电镜下大鼠海马CA1区神经元超微结构的改变假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态规则饱满,双层膜结构清晰,核内染色质分布均匀,胞浆内细胞器丰富,超微结构完整。模型组大鼠海马CA1区神经元细胞轮廓异型,核固缩,核周隙变大,核膜溶解内陷,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器溶解消失。E2组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态正常,双层核膜模糊,胞浆内细胞器虽然较丰富,但内质网明显扩张,高尔基体及线粒体均明显肿胀。E2+DKK1组大鼠海马CA1区神经元固缩,形态不规则,核膜溶解断裂,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器明显减少,糖原颗粒消失,线粒体消失,残存的内质网及高尔基体明显扩张。3免疫组化法观察大鼠海马β-catenin、Cyclin D1及GSK-3β的表达3.1光镜下β-catenin免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区β-catenin的IOD/area值较假手术组显著降低（P<0.05）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的β-catenin的IOD/area值显著增高（P<0.05）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,β-catenin的IOD/area值虽有所增高,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显著降低（P<0.05）。3.2光镜下GSK-3β免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区GSK-3β的IOD/area值较假手术组显著增高（P<0.01）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的GSK-3β的IOD/area值显著降低（P<0.01）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,GSK-3β的IOD/area值虽有所降低,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显著增加（P<0.05）。3.3光镜下Cyclin D1免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区Cyclin D1的IOD/area值较假手术组显著降低（P<0.01）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的Cyclin D1的IOD/area值显著增加（P<0.01）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,CyclinD1的IOD/area值虽略所增加,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显著降低（P<0.01）。4 Western blot 结果4.1 模型组:与假手术组相比,大鼠海马组织β-catenin蛋白表达量均显著减少（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达量显著减少（P<0.01）,GSK-3β蛋白表达量显著增加（P<0.01）。4.2 E2组:与模型组比较,经雌激素干预治疗后,这种趋势得到了明显逆转,β-catenin蛋白表达量显著增加（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达量显著增加（P<0.01）,GSK-3β蛋白表达量显著减少（P<0.01）。4.3 E2+DKK1组:与单独给予雌激素治疗相比,同时给予DKK1,大鼠β-catenin蛋白表达量显著减少（P<0.01）,Cyclin D1蛋白表达量显著减少（P<0.05）,GSK-3β蛋白表达量显著增加（P<0.05）。结论:雌激素治疗可减轻VD大鼠海马神经元损伤,给予Wnt通路抑制剂DKK1,使得雌激素的保护作用明显减弱,表明雌激素可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路发挥其作用。第五部分 雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响目的:探究雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响。方法:选取河北省人民医院妇科2019年1月至2020年1月收治的42例因良性病变行子宫及双侧卵巢切除患者为研究对象（术前均未绝经）,年龄48～54岁,分为两组,实验组为自愿接受雌激素治疗的患者22例,给予戊酸雌二醇片口服6个月;对照组20例,不接受激素治疗。比较用药后6个月两组患者血清雌二醇水平及认知功能变化。结果:治疗后实验组患者血清雌二醇水平较对照组显著增加（P<0.05）,蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）评分较对照组显著增加（P<0.05）。结论:雌激素替代治疗有助于改善手术绝经患者术后认知功能。