磷酸肌酸是医药上大量使用的原料药，用量不断增加，需求潜力巨大。磷酸肌酸既可用化学法合成，也可用酶催化合成。化学法合成磷酸肌酸由于条件苛刻，副反应多、分离纯化困难、产品纯度低、环境污染严重，不符合节能减排、可持续发展的国策；因而，亟需研发一种既绿色、又具有竞争优势的制备磷酸肌酸的方法。以赖氨酸修饰的交联壳聚糖微球作为载体，以戊二醛作为交联剂，采用交换-交联的方法固定化肌酸激酶，制备固定化肌酸激酶的最佳工艺条件为： pH为5.0，戊二醛﹕载体氨基：酶（摩尔比）=1.36﹕1﹕2.9E-04下，常温交换平衡，室温交联3h，固定化酶活力为21.6U/mg、活力回收68.%55。固定化肌酸激酶的主要酶学性质：Km=37.18mmol/L，为游离酶的1.09倍，Vmax=25.64mol/min mg植酸酶，为游离酶的83.6%；最适pH范围4～9，最适温度范围15～65℃，60℃半衰期为13.5h，室温（25℃）重复使用半衰期38次，4℃贮存半衰期301天。以固定化肌酸激酶装配成柱式生物反应器连续制备磷酸肌酸，最佳工艺条件为：温度40℃，pH=6.0，底物浓度为40mmol/L，底物流速为2.0mL/min时，连续制备磷酸肌酸，操作8h后，磷酸肌酸生成率为79.4%，固定化肌酸激酶的残余活力为78.6%，连续水解半衰期为18.69h。以阴离子交换树脂交换水解生成的产物，以0.05～2mol/L NaCl为洗脱剂对产物进行分离。以0.05mol/L NaCl，流速1BV/h，基本将ADP洗脱下来。以2mol/LNaCl，流速为2BV/h，基本将磷酸肌酸钠洗脱下来。磷酸肌酸钠洗脱液经结晶提纯，其纯度达到90.2%，产品经红外、核磁共振和高效液相分析确证。