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第一章胞外核苷酸对人内皮细胞增殖的影响及其机制研究第一节胞外核苷酸对人内皮细胞增殖、凋亡及自噬的影响目的：观察胞外核苷酸对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法：采用不同浓度的胞外核苷酸(ATP,ADP,UTP,UDP)持续干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-Cs),通过CCK-8细胞增殖试验检测其对HUVEC-Cs增殖的影响及时间效应,流式细胞术观察不同浓度的ATP/ADP对HUVEC细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响,质粒转染及免疫荧光技术观察高浓度的ATP/ADP对诱导HUVEC-Cs细胞自噬的影响,免疫印记进一步检测细胞的自噬活动。结果：与阴性对照组相比,ATP在低浓度(1,5,10μM)时对HUVEC-Cs增殖没有影响,ADP仅在1μM时促进细胞增殖,但ATP和ADP在高浓度(50,100μM)时均显著抑制细胞增殖,且呈时间依赖性,而UTP、UDP对HUVEC-Cs增殖没有影响；高浓度的ATP/ADP并不诱导HUVEC-Cs凋亡,但是显著增加S期的细胞比例,降低G2/M期的细胞比例,对G0/G1期细胞比例没有明显影响；细胞自噬试验表明高浓度的ATP/ADP显著诱导LC3-GFP融合蛋白的形成,免疫印记表明对照组与ATP/ADP干预组的HUVEC-Cs均表达高水平的LC3-1和LC3-2。结论：高浓度的ATP/ADP通过将细胞周期阻滞于S期并诱导细胞自噬性死亡而抑制HUVEC-Cs增殖,但并不涉及诱导细胞凋亡。第二节ATP抑制人内皮细胞增殖的机制研究目的：阐明ATP抑制人脐静脉内皮细胞增殖的具体机制。方法：采用RT-PCR检测静息状态下人内皮细胞表达的P2Y受体亚型,RT-PCR、Western-blot检测不同浓度的ATP对人内皮细胞表达P2Y2和P2Y,1的影响；通过CCK-8细胞增殖试验检测非特异性P2受体阻断剂苏拉明对ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的影响；shRNA质粒转染试验阐明介导ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的P2Y受体亚型；Western-blot检测高浓度的ATP对Erk信号通路的活化情况,CCK-8细胞增殖试验检测ERK通路阻断剂UO126和PD98095对ATP抑制细胞增殖效应的影响；流式细胞术检测ATP对顺铂诱导细胞死亡效应的影响,RT-PCR及P2Y11 shRNA质粒转染试验阐明其可能机制。结果：1、RT-PCR结果显示静息状态下,HUVEC-Cs表达高水平的P2Y2和P2Y11受体,同时表达低水平的P2Y1,4，13,14受体；原代的人主动脉内皮细胞表达高水平的P2Y11受体,同时表达低水平的P2Y2,4，3,14受体；RT-PCR结果表明ATP呈浓度依赖性上调HUVEC-Cs P2Y2:和P2Y11受体的mRNA表达；Western-blot结果表明ATP呈浓度依赖性上调HAECP2Y2和P2Y11受体的蛋白表达。2、CCK-8细胞增殖试验表明高浓度的ATP对HUVEC-Cs增殖的抑制作用可以被非特异性P2受体阻断剂苏拉明(100μM)完全阻断。3、P2Y2和P2Y11 shRNA质粒转染HUVEC-Cs 24h后,RT-PCR检测其瞬时转染效率,结果表明shRNA显著下调了HUVEC-Cs P2Y2(?)和P2Y11的mRNA表达；CCK-8细胞增殖试验表明同空白对照组相比,P2Yn shRNA组ATP在高浓度时对HUVEC-Cs增殖的抑制作用被阻断,而P2Y2shRNA组ATP在高浓度时仍显著抑制：HUVEC-Cs增殖。4、Western-blot结果表明ATP在100μM时呈时间依赖性活化ERK信号通路,其诱导ERK磷酸化的时间从1min持续到8min,其中以4～8min时最明显,且RATP诱导的ERK磷酸化可以被其特异性阻断剂UO126所阻断。UO126或者PD98095均可抑制或者协同ATP抑制HUVEC-Cs增殖(P＜0.05),但是并不能阻断ATP对HUVEC-Cs增殖的抑制作用。5、流式细胞术结果表明ATP在高浓度(50,100μM)时能显著增强顺铂诱导的细胞死亡效应(与单用顺铂组相比,P＜0.05),RT-PCR结果表明ATP在高浓度时明显下调Bcl-2及Bcl-2家族成员包括Bcl-w、A1和Mcl-1的mRNA表达水平,Western-blot结果表明,ATP可以协同顺铂降低Bcl-2的蛋白表达水平。6、P2Yn shRNA质粒转染HUVEC-Cs后,ATP在高浓度(50,100μM)时下调Bcl-2mRNA表达的效应被部分阻断,而且顺铂诱导的细胞死亡率明显降低(P＜0.05)。结论：ATP在高浓度时对HUVEC-Cs细胞增殖的抑制作用由P2Y11受体介导,该过程并不依赖于ERK信号通路的活化。高浓度的ATP通过P2Y11受体下调Bcl-2家族成员的基因表达水平,从而增强人内皮细胞对顺铂的敏感性。第二章胞外核苷酸对人脐血内皮祖细胞生物学功能的影响及其机制研究第一节胞外核苷酸对人脐血内皮祖细胞增殖的影响目的：分离纯化脐带血来源的单个核细胞并诱导培养为内皮祖细胞,观察胞外核苷酸对其增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法分离人脐带血中的单个核细胞,用含有多种生长因子的内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,通过形态学、免疫荧光及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测并鉴定细胞的生物学特性；采用RT-PCR检测静息状态下人内皮祖细胞(EPCs)表达的P2受体亚型,并采用不同浓度的胞外核苷酸(ATP,ADP,UTP,UDP)持续干预EPCs,通过CCK-8细胞增殖试验检测其对EPCs增殖的影响。结果：1、分离培养的内皮祖细胞早期以集落为中心呈放射状生长,晚期形成典型的“铺路石”样改变,DiL-acLDL和FITC-UEA-I双染阳性初步鉴定其为内皮祖细胞。RT-PCR结果表明早期的EPCs表达较高水平的干细胞表面标志物CD133、CD31和CD34,而弱表达内皮细胞表面标志物VE-Cadherin;2、RT-PCR结果显示静息状态下,EPCs表达较高水平的P2X4,6,7受体和P2Y2,4,11受体,同时也弱表达P2Y13,14受体；ATP、UTP在5μM时均能上调EPCs P2Y2受体mRNA的表达；3、与阴性对照组相比,仅ATP在高浓度(50,100μM)时显著抑制.EPCs增殖,而ADP、UTP、UDP对细胞增殖均没有明显影响。结论：人脐血中可分离培养出较高纯度的内皮祖细胞；高浓度的ATP显著抑制EPCs增殖,但介导该作用的P2受体亚型有待进一步研究。第二节胞外核苷酸对LPS诱导人脐血内皮祖细胞细胞因子表达的影响及可能机制目的：观察低浓度的ATP. UTP对LPS诱导EPCs细胞因子表达的影响并阐明其可能机制。方法：采用RT-PCR检测TLRs在EPCs中的表达情况及1mg/mL的LPS对EPCs细胞因子表达的影响；采用RT-PCR检测不同浓度的ATP. UTP(0,5,50μM)对EPCs表达TLR4、TLR4协同受体CD14和TLR调节蛋白MyD88的影响；采用RT-PCR检测ATP. UTP在5μM浓度时对LPS诱导EPCs细胞因子表达的影响；RT-PCR、Western-blot检测ATP. UTP在低浓度时对LPS诱导EPCs表达TLR4、CD14和MyD88的影响；Western-blot检测.ATP. UTP在低浓度时对LPS诱导EPCs NF-κB信号通路活化情况的影响。结果：1. RT-PCR结果显示静息状态下,EPCs表达TLR1～10,其中TLR4的表达水平最高,其次为TLR2,TLR1 0和TLR3; 1mg/mL的LPS能显著上调IL-1β、MCP-1、ICAM-1. VCAM-1.E-选择素、IFN-a和TNF-a在EPCs中的mRNA表达水平；2、不同浓度的ATP. UTP(0,5,50μM)干预处理EPCs后,RT-PCR结果表明ATP. UTP在5μM浓度时能显著下调TLR4、CD14和MyD88的mRNA表达；3. ATP. UTP在5μM浓度时能显著下调LPS诱导的MCP-1,VCAM-1, IFN-α和TNF-α在EPCs中的mRNA表达水平,而对IL-1β和ICAM-1的表达无明显影响；4、ATP、UTP在低浓度时显著下调LPS诱导的CD14和MyD88在EPCs中的mRNA和蛋白表达水平,同时也下调LPS诱导的TLR4mRNA在EPCs中的表达；5、ATP、UTP在低浓度时显著抑制LPS诱导的NF-κB磷酸化。结论：ATP/UTP在低浓度时能显著抑制LPS诱导的炎症因子和细胞因子在EPCs中的表达,该作用可能通过P2Y2受体负性调节TLR4信号通路,最终通过抑制NF-κB的磷酸化而实现。