论文部分内容阅读
反刍动物的能量代谢不同于其他动物,主要靠瘤胃微生物发酵产生的乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸供能。体内90%的葡萄糖是由糖异生供给的,其中由生糖先质丙酸经肝脏糖异生生成的葡萄糖约占50～60%。恢复和重建瘤胃微生物区系,不仅可增强围产期奶牛的消化功能,增加采食量,还可提高生糖先质丙酸的生成量,纠正或缓解围产期奶牛能量负平衡。拟运用瘤胃微生态理论和细菌代谢工程策略,通过PCR法和转座子诱变等方法;筛选、改造与丙酸生成有关的瘤胃发酵菌,构建瘤胃丙酸生成工程菌,调控瘤胃微生物发酵产生丙酸的比例,来为防治围产期奶牛能量代谢障碍性疾病开辟新的途径。本研究采集健康奶牛瘤胃液,应用厌氧菌分离程序,通过丙酸生成菌株的特异性培养基筛选瘤胃中丙酸生成优势菌,通过形态学和生化反应法初步鉴定为小韦荣球菌,再通过细菌遗传学鉴定方法-16SrRNA法,确认所分离的瘤胃厌氧菌为小韦荣球菌,并命名为V1,并利用转座子Tn5对细菌进行分子改造,通过供体菌E.coliS17-1/pZJ25∷Tn5与受体菌V1的转座子诱变,采用选择性培养基,共筛选出稳定的对氟乙酸具有抗性的转座工程菌12株,经过转座工程菌16S rRNA和Tn5的PCR鉴定及ACK和PTA酶比活力分析,确定TnV1属于PTA基因缺失型氟乙酸抗性菌株。小韦荣球菌V1及其构建的转座工程菌TnV1通过体外实验证实二者均能利用乳酸而生成VFA,发酵生成的VFA均以丙酸为主,发酵类型倾向于丙酸型,工程菌显著降低了C2/C3的比例。瘤胃内接种V1和TnV1,能显著降低瘤胃液中乳酸的浓度,同时能显著提高瘤胃液中丙酸的生成量,二者均显著降低乙酸/丙酸比例,利用乳酸使瘤胃内乳酸浓度大幅度下降,提示我们是否可利用V1和TnV1降解乳酸的特性用于围产期奶牛亚临床酮病性瘤胃乳酸酸中毒的预防和临床性瘤胃乳酸酸中毒的治疗。利用转座子诱变法筛选出ACK-PTA基因缺失型TnV1菌株,体内外实验表明在降低乙酸生成的同时并未大幅度增加丙酸的产量,是因转座子Tn5插入的干扰,还是过去有人怀疑的可能存在乙酸生成丙酸代谢途径的原因还无法确定,固对V1的ACK-PTA基因背景不清楚,而其他细菌已知的ACK-PTA基因又不能借鉴的情况下,本实验构建小韦荣球菌V1的基因组文库并用地高辛标记的探针来筛选文库,克隆乙酸生成基因ACK-PTA,试图说明转座子Tn5的插入位置,进而阐明其转座机理,为乙酸生成基因ACK-PTA的其他分子操作奠定基础。结果证实构建的基因组文库中包含小韦荣球菌V1的3-4kb的插入片段,文库滴度为105pfu/mL,根据公式N=ln(1-p)/(1-f)证明99%的基因组包含在文库中,证实我们成功构建了小韦荣球菌的基因组文库,并用原位菌落杂交法,地高辛标记的ACK探针来筛选文库,结果筛选到了1200bp左右的ACK基因,经序列比较分析发现,转座子并未插入到ACK基因中,推测可能插入到了PTA基因中。在进一步的研究中,我们要继续克隆PTA的全长基因,进一步了解转座子Tn5的转座机理。