论文部分内容阅读
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种广谱高效的抗菌剂，它可以和大多数药物和饲料添加剂混用，在喂养过程中稳定，药效不会降低。由于该类药物的广泛使用，使其在动物源性食品上的检出率越来越高，氯霉素在食品中残留会引起严重的后果，如可能抑制人体骨髓造血功能从而引起再生性障碍性贫血症等。而盐酸克伦特罗(clenbuterol hydrochloride，CL)是一种β2一肾上腺素受体激动剂。最初在临床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。因其具有改变动物的营养代谢，降低胴体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物增重，提高饲料使用率的作用被不法商人用于做饲料添加剂。然而β-激动剂在动物体内的蓄积性残留会对食用者的食用安全构成潜在威胁：人类食用超过盐酸克伦特罗残留限量的肉后会出现心悸、肌肉震颤、呕心呕吐、发热寒战等临床症状，特别对心脏病、糖尿病、高血压等病人危害更大。因此，研究用于氯霉素和盐酸克伦特罗的ELISA检测试剂盒，对于保护消费者利益，对于食品安全检测以及国际贸易有重要的意义。本研究对盐酸克伦特罗和氯霉素的人工抗原的合成以及ELISA检测方法的建立等进行了研究，得出如下研究结果：盐酸克伦特罗和氯霉素分别与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)通过重氮法合成了免疫抗原，经紫外、蛋白电泳实验证明半抗原与载体蛋白偶联成功，同时使用相同方法与载体蛋白卵白蛋白(OVA)合成了包被抗原。合作单位用合成的免疫抗原制备了氯霉素鼠单抗，盐酸克伦特罗兔多抗，用合作单位制备的氯霉素鼠单抗，盐酸克伦特罗兔多抗对氯霉素间接竞争ELISA检测方法进行了研究，得到上述ELISA检测方法的灵敏度、线性范围、线性拟合并对检测步骤、检测时间等因素进行了优化，结果显示较合适的检测条件为：鼠单抗使用浓度为稀释1600倍，包被抗原稀释100倍并且4℃包被12小时可获得较好的试验结果。其他条件通过优化实验，最终选择最佳包被时间为4℃12h，一抗最佳作用时间为60min，二抗最佳作用时间为60min，底物作用时间为15min。对底物配方进行优化，得到TMB和H202的最佳组合为450μLTMB(10mgTMB溶于2mLDMSO)+5μL的H202。用优化后的间接竞争ELISA检测方法测得氯霉素最低检测限0.3837ng/mL，接近到欧盟法规(EC-decisions 2003/181/EC and 2004/25/EC)规定的0.3ng/mL。同时，盐酸克伦特罗也采用间接ELISA方法其兔多抗浓度为稀释8000倍，包被抗原稀释100倍后，包被时间为4℃12h。其他条件通过优化实验，最终得到一抗最佳作用时间为60min，二抗最佳作用时间为40min，底物作用时间为15min。对底物配方进行优化，得到TMB和H202的最佳组合为400μLTMB(10mgTMB溶于2mLDMSO)+7μL的H202。用优化后的直接竞争EMSA检测方法测得盐酸克伦特罗最低检测限1.52ng/mL。