背景:近年来,感染性的疾病仍然是危害人类健康的最大隐患,尤其是在发展中国家。世界卫生组织宣布,近30年来,发现了29种新的病原体。当前,造成人类感染性疾病的病原微生物种类日益复杂,常见的病原体对人类的威胁还没有消除,又有一些新的病原体出现,给疾病的诊断和治疗带来了很大的困难。大量的研究数据表明:随着抗生素的滥用,不仅使患者的负担加重了,而且产生的耐药菌株也越来越多,疾病治疗的难度提高了。因此,对病原微生物早期的快速、准确的识别和鉴定,不仅可以使用适当的抗生素治疗,而且能够有效提高患者的预后,是目前降低死亡率最有效的方法。目前对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌等常见病原微生物的检测和鉴定主要是通过分离培养结合形态特征、应用生化实验和免疫分析等方法,在临床实践中,由于培养操作复杂、耗时较长、特异性不强等原因,会导致假阳性或假阴性结果的出现。这些都是当前病原微生物检测方法的不足。随着分子生物学在医学领域的广泛应用,病原微生物的基因检测已成为临床疾病诊断不可缺少的方法。而且大量病原微生物的核酸序列组成已经获得,并收录于核酸序列数据库中,这使得以核酸为目标的病原微生物检测鉴定方法成为可能。生物传感器是生物分子(核酸、蛋白质、生物膜等)与物理化学有机结合的交叉学科,在实验室诊断和监控领域方面的应用是非常广阔的。生物传感器的检测原理是将生物学的反应信号转换为易于检测、传输和处理的电信号,然后再经二次转换为仪表可以放大和输出的数字信号的过程。由于转换器的不同,可将生物传感器分为半导体生物传感器、电化学传感器、压电晶体生物传感器、表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)生物传感器等。其中,SPR生物传感器可以利用病原微生物的核酸进行检测,而且可以达到高度平行检测。SPR是一种利用光的反射和折射的光学检测技术,由于光学装置具有灵敏度高、免标记、操作方便以及可以实时、快速、在线检测等优点。在过去的多年中,SPR生物传感器已被广泛用于检测多种生物分子间的相互作用,包括蛋白质、肽、核酸、细菌和病毒等。在SPR生物传感器芯片中,金属表面结合生物分子后将引起SPR折射率以及入射角的改变,因此可以通过监测SPR角度的变化来研究生物分子间相互作用。为了更有效的提高SPR变化信号,本研究利用固相纳米-滚环扩增技术,对SPR信号进行有效放大。滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是近些年发展起来的一种恒温扩增核酸的方法。RCA反应以环状的DNA分子为模板,通过一条短的启动序列(与部分环状DNA模板分子杂交互补),在Phi 29 DNA聚合酶的催化作用下将d NTPs转变成一条长的单链DNA片段,RCA反应产物含有大量重复的DNA模板序列,从而实现对靶核酸的扩增,RCA技术已成功地应用于检测不同的病原体。与传统分子生物学方法相比,RCA不需要特殊的温控仪器、能够线性扩增、RCA产物易于固定在生物芯片等优势。近年来,由于金纳米颗粒(Au NPs)独特的物理化学性能和较高的比表面积,在生物亲和性试验领域已经吸引了越来越多的关注,这主要是因为金纳米颗粒的金属表面对具有硫醇基团的生物分子具有较强的稳定固定化的能力。由于金纳米颗粒提供了快速、高效和高通量的检测平台,也越来越多地用于SPR生物传感器上。因此,本研究在课题组前期研究的基础上,基于纳米-滚环扩增(nano-RCA)技术,设计6种病原微生物基因DNA的锁式探针(Padlock Probe,PLP),特异识别基因组靶序列,通过连接酶连接成环形的锁式探针,继而作为滚环扩增的环形模板,与表面等离子体共振(SPR)生物传感器芯片表面固定的捕获探针杂交,建立生物传感器芯片表面滚环扩增系统,原位复制环形锁式探针,扩增传感器表面锁式探针与捕获探针的杂交信号,再利用纳米金修饰探针与扩增产物杂交,实现信号的再次放大。结合传感器微阵列技术,实现生物传感器芯片对6种病原微生物的特异、灵敏、快速、高通量的检测,并对生物传感器检测方法与传统方法进行方法学与统计学评价,创建一种恒温型纳米-滚环扩增-表面等离子体共振(nano-RCA-SPR)生物传感器快速检测常见病原微生物的方法,为病原微生物的鉴定和疾病的早期诊断提供坚实的实验基础。目的:建立一种既能直接接触基因组DNA,又具有信号扩增放大效应的恒温型纳米-滚环扩增-表面等离子体共振生物传感器芯片技术,为常见病原微生物的检测提供一种灵敏、特异、高通量、简便快速的生物传感器方法。探讨表面等离子体共振生物传感器固相表面滚环扩增效应的响应机理和影响因素,证实其放大SPR生物传感器芯片表面生物反应信号的可行性,为复杂样品中微量待测生物标志物的检测提供高灵敏度、高特异的解决方案。方法:1.探针的设计:Gen Bank数据库中查找这6种病原菌(大肠埃希菌(E.coli)、粪肠球菌(E.faecalis)、痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus))的16S r DNA基因组序列,筛选适合设计锁式探针的靶序列,根据靶序列设计具有Quick CutT M Hpa I酶切位点的锁式探针以及相应的捕获探针,同时利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件预测锁式探针、捕获探针、信号放大探针和通用序列的二级结构。利用Array Designer软件,保持各探针间具有较好的一致性和特异性。2.建立液相RC A反应体系:以合成的6种病原菌靶序列为模板,建立液相RCA反应扩增体系,通过琼脂糖凝胶电泳以及实时荧光定量PCR,验证锁式探针、靶序列和捕获探针的连接与扩增有效性和特异性。3.SPR生物传感器的改进:在课题组前期研究的基础上,对SPR传感器的检测平台进行优化,改进样品流速控制系统、改善检测通道和改进传感器的温控装置,对生物传感器芯片表面的自组装技术进行优化。4.生物传感器芯片表面生物膜的制备以及捕获探针的固定:根据生物素和链霉亲和素的共价偶联作用,将生物素化的捕获探针固定在芯片表面,探讨结合有纳米金的捕获探针在芯片表面固定的浓度对SPR信号值的影响。5.固相RC A反应体系的条件优化:分别探讨锁式探针和靶序列在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃温度条件下的连接效率和特异性以及最佳杂交连接的时间;10U、15U和20U的E.coli DNA Ligase用量对探针连接成环效率的影响;ExonucleaseⅠ和ExonucleaseⅢ的使用对扩增体系特异性的影响,确定SPR生物传感器芯片表面的固相RCA反应的最佳实验条件。6.固相RC A反应与纳米金信号放大:纳米金修饰的探针与固相表面的RC A产物的重复序列进行杂交,产生较强的信号放大效果。对纳米金信号放大系统的实验条件进行优化,并以合成的DNA分子为模板检测反应系统的特异性和灵敏度。7.交叉试验验证平行扩增检测:6个病原菌的特异捕获探针分别固定在6个相应的检测池中,每次只加入带有一种病原菌的模板,重复多次,交叉验证本研究方法可进行多重平行扩增检测。8.临床标本检测与统计分析:利用纳米金信号放大的SPR生物传感器方法检测50例临床标本,与传统的病原菌检测方法(Dade Behring Micro Scan全自动微生物分析系统和法国生物梅里埃ATB自动微生物鉴定方法)进行对照,并做Kappa检验;对建立的恒温型nano-RCA-SPR生物传感器检测方法进行方法学评价,确定临床病原菌样本检测的具体步骤。结果:1.通过C lustal X2和在线BLAST比对,找到了6种病原菌(E.coli、E.faecalis、S.dysenteriae、S.pneumoniae、S.epidermidis、S.aureus)适合设计锁式探针的靶序列,针对靶序列设计具有Quick CutT M Hpa I酶切位点的锁式探针以及相应的捕获探针,并经Primer Premier 5.0和Oligo 6软件预测了锁式探针和捕获探针的二级结构,连接成环后的锁式探针二级结构也少,探针之间具有相近的Tm值,这样保证了锁式探针与靶序列识别的特异性和RCA反应扩增的效率。2.以合成的6种病原菌靶序列为模板,建立液相RCA反应扩增体系,RC A扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳以及实时荧光定量PCR结果显示,带有靶序列的泳池有RCA产物的电泳条带,其他泳道没有电泳条带,说明本研究设计的锁式探针能有效的、特异的识别病原菌靶序列,可用于病原菌的分子水平检测。3.在课题组前期研究的基础上,优化了恒温型nano-RCA-SPR生物传感器检测仪,SPR生物传感器芯片是镀金膜棱镜,金膜厚度约是50nm;流速控制范围是5-1500μL/min,流速精度控制为±1μL/min;检测通道为8个串联流池;温度控制范围是20℃-50℃,精度是±0.1℃;利用生物素-链霉亲和素系统共价修饰作用,将生物素化的捕获探针自组装到芯片金膜上。4.在室温下,生物素抗体固定在SPR传感器芯片表面的金膜上,结合有纳米金的链霉亲和素与生物素抗体共价结合,最后分别将6种病原菌的捕获探针固定在芯片表面6个不同的流池中,最佳捕获探针浓度是1μM。5.锁式探针与靶序列DN A杂交温度为60℃时,PLP的环化连接效率最好、反应特异性最高;最佳杂交连接的时间是30min;当E.coli DNA Ligase用量为10U/15U/20U时,RCA产物无显著差异,故选用10U为最佳连接酶的用量。当锁式探针的连接产物不使用ExonucleaseⅠ和ExonucleaseⅢ酶切时,有非特异性的扩增产物出现,使用ExonucleaseⅠ和ExonucleaseⅢ酶切未连接的锁式探针,可以提高本研究检测的特异性。6.基于纳米金颗粒信号放大的SPR生物传感器检测方法可提高检测的灵敏度,在10%(v/v)浓度下,直径为15nm的纳米金颗粒的SPR信号值比较高,与对照组比较有显著性差异(p<0.01)。对人工合成的模板DNA分子的检测限是5×10-13 M((51.6±7.2)×10-5RIU),而且浓度范围在5×10-13 M至5×10-7 M内呈线性相关(y=503.5 x+6126.0,R2=0.9853)。7.建立的基于纳米金颗粒信号放大的SPR生物传感器检测方法,可在3h内完成对E.coli、E.faecalis、S.dysenteriae、S.pneumoniae、S.epidermidis和S.aureus的恒温快速检测,实现了SPR生物传感器芯片表面各流池的平行扩增检测,各个病原菌的交叉试验结果显示SPR角度信号值变化比较明显(p<0.01),说明无交叉反应。8.通过纳米金信号放大的SPR生物传感器检测方法检测的50例临床标本,对临床病原菌标本基因组DNA的检测限是0.5 pg/μL((71.8±8.1)×10-5RIU)。与传统临床方法(Dade Behring Micro Scan全自动微生物分析系统和法国生物梅里埃ATB自动微生物鉴定方法)比较,本研究方法检测临床标本的灵敏度和特异性分别为E.coli:92.6%和95.7%;E.faecalis:100.0%和100.0%;S.dysenteriae:100.0%和100.0%;S.pneumoniae:94.7%和93.5%;S.epiderm idis:95.7%和96.3%;S.aureus:100.0%和97.3%。通过Kappa检验,这两种检测方法的结果具有显著的一致性(p<0.01,Kappa>0.75)。结论:1.成功设计了检测6种病原菌E.coli、E.faecalis、S.dysenteriae、S.pneumoniae、S.epiderm idis、S.aureus的锁式探针以及相应的捕获探针,构建并优化了液相和固相RC A扩增反应体系,可在有背景信号干扰下识别目标靶序列,还可以实现多种目标靶序列的平行连接和扩增反应。从而实现SPR生物传感器芯片的平行扩增反应,由于实验的反应条件比较一致,没有交叉反应,可用于生物传感器的高通量检测。2.恒温型nano-RCA-SPR生物传感器检测方法,降低了一般基因诊断方法对PCR扩增方法的依赖。由于其稳定的检测系统、简单方便的操作和芯片的可重复利用,有利于SPR传感器检测方法应用于临床标本的检测。3.利用生物素-亲和素系统的信号一级放大、固相RCA反应的信号二级放大以及纳米金颗粒的信号三级放大,有效提高了SPR生物传感器芯片表面的响应信号值,可显著提高SPR生物传感器的灵敏度。这种方法为SPR传感器快速检测痕量物质分子提供了一个可靠的检测平台。该方法将会在分子水平,核酸快速检测方面得到越来越多的应用。4.恒温型nano-RCA-SPR生物传感器检测方法,不仅可以保证检测病原菌的特异性和灵敏度,还可以快速的实现对固相RCA反应的实时、在线的无标记监测,为核酸分子水平的扩增和鉴定提供了新方法。5.成功构建的恒温型SPR传感器检测方法,可在3个小时内同时平行检测6种临床常见的病原微生物,检测方法具有过程方便快捷、无需标记、样品需要量少、快速、灵敏和特异等特点。与传统的临床方法和基因芯片技术相比,降低了技术要求和检测的成本。为常见临床病原微生物的快速检测和其他痕量基因诊断提供了新思路,从而解决现有临床常规检测方法存在的不足,满足临床快速、准确的诊断需求,其应用前景将是非常广阔的。