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在大肠杆菌中过表达重组蛋白时,常常因为重组蛋白不能正确折叠而形成包涵体。过表达伴侣蛋白如GroELS、DnaK-DnaJ-GrpE和Trigger factor等能够有效帮助蛋白质正确折叠,获得更多可溶的、有活性的蛋白质。已经构建了一些过表达伴侣蛋白的质粒,但是在质粒上表达伴侣蛋白有很多缺陷:质粒容易丢失导致伴侣蛋白表达不稳定、需要抗生素压力来维持质粒复制从而影响菌体生长。此外,在促进重组蛋白可溶性表达时,伴侣蛋白的量至关重要;质粒上表达的伴侣蛋白过多,会促进蛋白质水解和降低重组蛋白产量。所以构建一株伴侣蛋白稳定表达、适量表达的工程菌至关重要。本研究利用Tn5转座酶建立了目标基因在基因组上多次、单拷贝插入的新方法,并利用此方法构建了基因组上含有1-4个拷贝groELS的E.coliBL21(DE3)工程菌;探索了在促进重组蛋白可溶性表达时,E.coli BL21(DE3)基因组上groELS的最佳拷贝数。1.Tn5转座酶介导的基因多次插入方法的建立利用pET系统对Tn5转座酶进行了表达,在亲和层析中利用含20mM咪唑的1M NaCI-TEGX高盐缓冲液洗掉与镍柱非特异性结合的杂蛋白,降低Tn5转座酶与降解的转座酶之间的相互作用,获得活性较高的Tn5转座酶。对转座反应体系和反应时间进行优化,提高了转座效率,建立了新的Tn5体外转座方法,使外源基因单拷贝插入到宿主基因组中变得简单易行。通过在转座片段groELS上加入两侧带有FRT位点的kan作为标记,筛选转座后的阳性克隆;利用FLP酶的位点特异性重组实现了kan筛选标记的重复利用,从而可以实现基因在宿主基因组上的单拷贝、多次的整合。该方法既能实现同一基因在基因组上的单拷贝整合和多拷贝整合,也能完成不同基因在基因组上的整合,有潜力应用于合成生物学和代谢工程中。2.利用Tn5转座酶方法构建伴侣蛋白GroELS工程菌利用本课题已经建立的Tn5转座酶方法首次实现同一基因在基因组上的多次单拷贝整合,构建了基因组上额外含有1-4个拷贝groELS的E.coli BL21(DE3)工程菌;经验证该工程菌基因组上的多拷贝groELS是长期稳定存在的,且菌株的生长状态没有受到影响。此工程菌相对于伴侣蛋白在质粒上表达的工程菌来说,更适合应用于工业生产,因为无需抗生素维持,不会给菌体本身造成负担。3.促进重组蛋白可溶性表达所需伴侣蛋白groELS的最佳拷贝数探索通过诱导表达,发现含有1-4个拷贝groELS的工程菌可以产生不同浓度的伴侣蛋白GroELS;我们从十一种重组蛋白中筛选出七种受GroELS影响后可溶性表达的目标蛋白,并挑选了三种具有代表性的目标蛋白来探索伴侣蛋白groELS的最佳拷贝数。这三种目标蛋白分别是来自Chelativorans sp.BNC1的EDTA降解途径重要的单加氧酶EmoA、来自人线粒体的硫双加氧酶ETHE1和来自条件致病菌Pseudomonas aeruginosa PAO1的硫醌氧化还原酶Sqr(AAG05733)。我们发现2-3个拷贝groELS可以获得最高的可溶性蛋白产量,再多的伴侣蛋白GroELS反而会降低重组蛋白的产量。该工作证实重组蛋白的表达量会受到伴侣蛋白GroELS表达量的影响,通过寻找最佳的GroELS表达量,可以最大程度地节约细胞能量,减少重组蛋白的降解,提高重组蛋白的产量。该工作有潜力应用于重组蛋白的生产、研究以及代谢工程中。