超低温保存脱除香蕉束顶病毒的研究

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香蕉束顶病是香蕉生产上的严重病害之一。在生产中推广无病毒苗是有效控制病毒的方法之一。获得无病毒母株,常规脱除病毒主要方法有茎尖脱毒和热处理。超低温保存种质资源,同时可以脱除病毒,试验研究超低温脱除香蕉束顶病的现象。以感染香蕉束顶病的巴西蕉[Musa acuminaxe(AAA group)Dwraf Cavendish cv.Baxi]为材料,对玻璃化法超低温保存脱除香蕉束顶病毒的方法及原因进行了初步研究。试验主要结果如下:1.比较了感染香蕉束顶病的巴西蕉吸芽外植体的灭菌及培养方法,发现多芽外植体采用0.1%升汞灭菌12~14 min,在灭菌率和外植体再生之间可以达到较好的平衡;外植体萌发的无菌芽在MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L的培养基上分化较好;无菌芽在MS+6-BA2.0 mg/L+0.2 NAAmg/L的培养基生长较好,叶片浓绿,蕉苗粗壮。2.香蕉茎尖培养条件进行了优化:发现茎尖在液体培养基上进行暗培养、置于摇床(110 r/min,25℃)上摇动,茎尖培养7d即可伸长0.76cm,一个月后增殖系数达到1.9。在固体培养基暗培养条件下,茎尖培养7d伸长0.65cm,且增殖率高达2.7,这是一个经济实用的方法。3.采用石蜡切片方法,观察了超低温保存过程中茎尖结构的变化。结果表明在超低温保存过程中,茎尖外围几层细胞死亡,有效地减少了香蕉茎尖物理体积,减少了茎尖携带病毒的细胞数目。分生组织细胞细胞质浓厚,自由水含量低,相对成活率高;这部分茎尖不带病毒或携带病毒浓度低,因此,萌发出植株的不带病毒的株数增加,提高了茎尖的脱毒率。4.检测了香蕉束顶病的病毒。Primer up:ATT ACT CGA GCT CGG GAC GGG ACAT(65.3℃);Primer down:TATACT CGA GGG GTAATAATA TAC CCC(60.5℃)。20μl PCR体系:2ul 10×PCR buffer;0.6μl Taq酶(2U/μl);0.4μl dNTP(10 mM);0.6μl Primer(10 mM);2μl Template;13.8μl ddH2O。循环程序:94℃,3min;94℃,1 min,54℃,30 s,72℃,30 s;循环35次,72℃,10min。5.玻璃化法超低温保存脱除病毒实质是微茎尖脱毒。玻璃化法超低温保存脱除毒达60.6%,远高于茎尖脱毒26.7%。
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