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黄鳝(Monopterus albus)卵巢的石蜡切片表明:卵黄发生晚期(GSI为16.7﹪)的卵巢与处于卵黄发生中期(GSI为3.7﹪左右)的卵巢在结构上有明显的差别,并且在卵黄发生晚期的卵巢中有较为明显的雄性组织。应用抑制性差减杂交(Suppression Subtraction Hybridization,SSH)技术构建了这两个时期性腺抑制性差减文库。从中随机挑取1200个克隆进行了PCR和斑点杂交筛选,得到140差异表达的cDNA片段。挑选了95个cDNA克隆测序,测序结果经GenBank检索和生物信息学比较分析,其中80个片段与已知的序列有较高同源性,另外有15个片段与NCBI数据库中没有明显同源性的基因。在正向文库(Fs)找出一系列呼吸链上的相关基因的片段,包括NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)subunit 1和4,细胞色素b(cytochrome b,Cytb),细胞色素C氧化酶(cytochromec oxidase)subunit 1、2和3;ATP合成酶(ATPase)subunit 6,此外还找到载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因片段,solute carrier family 44,member 3基因片段;在反向库(Rs)找到与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)C型甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)有较高同源性的基因。
我们还建立了这两个时期卵巢的SMART cDNA文库及其cDNA差减文库。从中随机挑取了1000个克隆,进行了PCR和斑点杂交筛选,得到80个差异表达的cDNA片段,挑选了50个cDNA克隆测序,测序结果经GenBank检索和生物信息学比较,发现其中13个片段与报道的基因有较高的同源性。在正向(SFs)除了找到的上述呼吸链上的相关基因NADH脱氢酶subunit 1外,还发现PR/SET domain containing protein 8a基因,hydroxyl-delta-5-steroid dehydrogenase,3 beta- and steroid delta-isomerase 7基因, VHSV-induced protein基因, short-chain Dehydrogenase/reductase(SDR family)member 7基因以及BMS1-like,ribosome assembly protein基因片段。在反向(SRs)中,找到Dab2 protein,TSC22 domain family,egg envelope glycoprotein,BTB(POZ)domain containing 8,isoform CRA_c,以及zonadhesin基因片段。另外,还发现一些片段与原核生物基因有较低的同源性,有25个片段与GenBank中序列无明显的同源性。应用半定量RT-PCR初步分析了上面所获得的黄鳝Cox Ⅰ和ApoE基因在不同性腺发育阶段的表达,结果表明:在GSI>5﹪的卵巢中表达明显升高,这与抑制性差减杂交结果一致。