猪繁殖与呼吸综合征（PRRS,又称蓝耳病）和猪流行性腹泻（PED）等疾病严重困扰我国养猪业,给我国经济造成了巨大损失。由于病毒致病机制复杂、病毒变异快,目前还不能利用疫苗免疫彻底防控上述疾病。研究人员通过编辑CD163基因（PRRSV受体）成功地培育了抗PRRS猪,可有效抵抗PRRSV感染,给猪抗PED等疾病的育种提供了策略和信心。然而,可用于抗PED育种的重要基因,以及用于研究猪抗PRRS或PRRSV-宿主互作机理等其它重要基因（除CD163外）仍需要继续进行研究和挖掘。本实验室前期利用全基因组基因敲除的猪源g RNA文库及高通量基因筛选技术筛选出了PRRSV感染相关的55个候选基因。本研究根据基因功能及其所在信号通路,从55个候选基因中选取三个候选基因（IL20RB、ATP6V0A1和STX10）,验证这三个基因分别在PRRSV和PEDV增殖中的作用。此外,为了更快速高效地探讨所筛选的候选基因对多种猪病毒感染增殖的作用,从筛选出的55个猪候选基因中选取另外八个候选基因（本实验室已证实可显著调控PRRSV增殖）,构建其同源猴基因敲除的g RNA表达载体,用于制备可感染多种猪病毒的非洲绿猴肾细胞系Marc145的敲除细胞,为探讨候选基因对多种病毒感染的作用提供研究材料。主要结果如下:1.研究了IL20RB、ATP6V0A1和STX10基因分别敲除对PRRSV增殖的作用:利用本实验室已制备的可用于基因敲除且感染PRRSV的猪细胞系（PK15-CD163-Cas9）和CRISPR/Cas9技术制备了分别敲除三个基因的三种细胞（PK15-CD163-Cas9-ATP6V0A1、PK15-CD163-Cas9-IL20RB和PK15-CD163-Cas9-STX10）;用PRRSV分别感染基因敲除的三种细胞（试验组）和未敲除基因的细胞（对照组）,利用荧光定量PCR分别检测PRRSV的ORF7表达水平,试验组细胞中ORF7表达水平均显著低于对照组,表明了分别敲除IL20RB、ATP6V0A1和STX10均可显著抑制PRRSV感染;2.分析了IL20RB、ATP6V0A1和STX10基因分别敲除对PEDV增殖的作用:为了探讨对PRRSV增殖具有显著调控作用的三个基因对PEDV增殖的影响,利用本实验室前期制备的可用于基因敲除且能感染PEDV的猪细胞系（IPEC-J2-Cas9）和CRISPR/Cas9技术制备了三个基因分别敲除的细胞（IPEC-J2-Cas9-ATP6V0A1、IPEC-J2-Cas9-IL20RB和IPEC-J2-Cas9-STX10）;用PEDV分别感染三个基因分别敲除的三种细胞（试验组）和未敲除基因的细胞（对照组）,利用荧光定量PCR分别检测了PEDV的增殖水平,与对照组相比,在IL20RB、ATP6V0A1和STX10分别敲除的三个试验组细胞中PEDV的增殖水平均显著降低,证明了分别敲除IL20RB、ATP6V0A1和STX10均可显著抑制PEDV增殖;3.利用CRISPR/Cas9技术,构建和慢病毒包装了分别靶向八个基因（VTN、F11R、UBB、LGALS2、MAP4K3、NDUFB3、PPP2CA、KXD1）敲除的g RNA表达载体:因为猴Marc145细胞可被多种猪病毒感染且是猪病毒研究最常用细胞模型之一,为了更快速高效地探讨所筛选的猪候选基因对多种猪病毒感染增殖的作用,本试验以本实验室前期已证实与PRRSV感染增殖相关的另外八个猪基因（来自55个候选基因）为研究对象,在NCBI数据库中获得与这八个猪基因同源的八个猴基因,每个基因设计了2条g RNA,用于构建了八个基因分别敲除的15个g RNA表达载体（其中1个载体连接效果不佳）,并对其进行了慢病毒包装,将用于制备基因敲除细胞和鉴定对多种猪病毒感染具有调控作用的重要基因。本研究结果将为动物抗病育种、防治药物、疫苗设计研发,以及研究这些基因功能、猪抗PRRSV或PEDV感染增殖的机理等打下基础。此外,还需要深入研究这三个基因对PRRSV或PEDV增殖的调控机理,以及对其它猪病毒感染、多种猪病毒同时感染的作用与机理。