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肾细胞癌,简称肾癌,是常见的泌尿系统恶性肿瘤。肾癌发病隐匿,早期缺乏典型临床症状,诊断率较低。部分肾癌患者在确诊时已处于中晚期,预后较差。探究肾癌的发病机制并寻找早期诊断的生物标志物及治疗靶标对于改善肾癌预后具有重要意义。环状RNA(circRNA)和微小(miRNA)是两类小分子非编码RNA,且circRNA可发挥微小RNA(miRNA)分子海绵作用调控miRNA靶基因的表达,进而发挥生物学调控功能。circ_0054537属于circRNA家族成员,其对肾癌发生发展的影响及分子机制还未明确。circular RNA Interactome靶基因在线软件预测显示,circ_0054537可能靶向结合miR-640;micro T CDS靶基因在线软件预测显示,神经元正五聚体蛋白2(NPTX2)可能是miR-640的靶基因。本研究首先检测了circ_0054537在肾癌组织的表达,分析circ_0054537表达与肾癌患者临床特征的关系;其次,探究circ_0054537对体外肾癌细胞系恶性生物学行为及体内肿瘤生长的影响;最后,以miR-640/NPTX2轴为切入点,探究circ_0054537影响肾癌细胞恶性生物学行为的分子机制。第一部分circ_0054537在肾癌组织中的表达及临床意义目的:探究circ_0054537在肾癌组织中的表达及临床意义。方法:1.收集2016年11月至2019年11月于河北医科大学第四医院接受根治性切除术的70例肾癌患者的癌组织和癌旁正常组织,qRT-PCR法检测组织中circ_0054537的表达量。2.根据肾癌组织中circ_0054537表达的均值将肾癌患者分为circ_0054537高表达组和circ_0054537低表达组,卡方检验分析肾癌组织中circ_0054537的表达与患者临床特征的关系。结果:肾癌组织中circ_0054537的表达明显高于癌旁组织(P<0.05),且肾癌组织中circ_0054537的表达与TNM分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。高TNM分期、淋巴结转移的肾癌患者癌组织中circ_0054537的表达高于低TNM分期、淋巴结未转移患者(P<0.05)。结论:circ_0054537在肾癌组织中呈高表达,且circ_0054537表达与患者TNM分期、淋巴结转移密切相关。第二部分circ_0054537对肾癌细胞恶性生物学行为及体内肿瘤生长的影响目的:探究circ_0054537在肾癌细胞系中的表达及其对肾癌细胞系恶性生物学行为的影响。方法:1.以人肾小管上皮细胞HK-2为对照,q RT-PCR法检测肾癌细胞系(786-O、A498)中circ_0054537的表达。2.核质分离实验检测circ_0054537在肾癌细胞系(786-O、A498)中的定位,RNase R实验检测circ_0054537的稳定性。3.将si-con、si-circ_0054537#1、si-circ_0054537#2、si-circ_0054537#3转染至肾癌细胞系(786-O、A498)中,q RT-PCR检测细胞中circ_0054537的表达验证转染效果。4.于细胞培养板中接种si-con组和si-circ_0054537#1组肾癌细胞系(786-O、A498),CCK-8法和EdU实验检测细胞增殖,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting法检测细胞中凋亡相关蛋白BAX和BCL2的表达。5.将感染sh-con(sh-con组)、sh-circ_0054537(sh-circ_0054537组)慢病毒的肾癌细胞A498注射至裸鼠左后肢皮下,同时设置对照组(Mock组,注射等量生理盐水)。观察移植瘤体积变化,并于4周后剥离移植瘤并称重,q RT-PCR法检测瘤体组织中circ_0054537表达。结果:1.与HK-2细胞比较,肾癌细胞系(786-O、A498)中circ_0054537的表达量明显升高(P<0.05)。2.circ_0054537主要定位于肾癌细胞系(786-O、A498)的细胞质中;肾癌细胞系(786-O、A498)中circ_0054537的表达不受RNase R影响(P>0.05),证明circ_0054537为闭环结构,不易被核酸外切酶降解。3.与si-con组比较,si-circ_0054537#1组、si-circ_0054537#2组、si-circ_0054537#3组肾癌细胞系(786-O、A498)中circ_0054537的表达均明显降低(P<0.05),且转染si-circ_0054537#1的肾癌细胞系(786-O、A498)中circ_0054537的表达差异最显著,因此,选择si-circ_0054537#1进行后续实验。4.与si-con组比较,si-circ_0054537#1组肾癌细胞系(786-O、A498)的OD值、EdU阳性率、迁移数、侵袭数及细胞中BCL2蛋白表达均明显降低(P<0.05),而细胞凋亡率和细胞中BAX蛋白表达升高(P<0.05)。5.与Mock组或sh-con组比较,sh-circ_0054537组移植瘤体积明显减小(P<0.05),瘤体重量降低(P<0.05),移植瘤组织中circ_0054537的表达降低(P<0.05)。Mock组与sh-con组移植瘤体积、肿瘤及移植瘤组织中circ_0054537的表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:circ_0054537在肾癌细胞系中表达升高,敲低circ_0054537可抑制体外肾癌细胞系增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡;同时,敲低circ_0054537抑制体内肿瘤生长。第三部分circ_0054537靶向miR-640/NPTX2轴影响肾癌细胞恶性生物学行为的机制研究目的:探究circ_0054537影响肾癌细胞系恶性生物学行为的分子机制。方法:1.GEO数据库中GSE61741数据集分析miR-640在肾癌组织中的表达。GEPIA数据库分析NPTX2在肾癌组织中的表达。qRT-PCR法检测收集的70例肾癌组织和癌旁正常组织中miR-640和NPTX2 m RNA的表达,Western blotting法检测组织中NPTX2蛋白表达。Pearson相关性分析肾癌组织中circ_0054537与miR-640、miR-640与NPTX2 m RNA表达的相关性。2.以人肾小管上皮细胞HK-2为对照,qRT-PCR法检测肾癌细胞系(786-O、A498)中miR-640的表达,Western blotting法检测肾癌细胞系(786-O、A498)中NPTX2蛋白表达。3.circularRNA Interactome靶基因在线软件预测,circ_0054537可能与miR-640存在靶向调控关系;microT CDS靶基因在线软件预测显示,NPTX2可能是miR-640的靶基因。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验验证circ_0054537与miR-640、miR-640与NPTX2的靶向关系。4.将肾癌细胞系(786-O、A498)分为si-con组、si-circ_0054537#1组、si-circ_0054537#1+in-miR-con组、si-circ_0054537#1+in-miR-640组,miR-con组、miR-640组、miR-640+pc DNA组、miR-640+NPTX2组,q RT-PCR法检测细胞中miR-640表达,Western blotting检测NPTX2蛋白表达,CCK-8法和Ed U实验检测细胞增殖,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting法检测细胞中凋亡相关蛋白BAX和BCL2的表达。结果:1.GEO数据库中GSE61741数据集分析结果显示,肾癌组织中miR-640的表达低于正常组织。GEPIA数据库分析显示,肾癌组织中NPTX2的表达高于正常组织。q RT-PCR检测结果显示,70例肾癌组织中miR-640的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.05),NPTX2 m RNA和蛋白的表达均高于癌旁组织(P<0.05)。Pearson相关性分析结果表明,circ_0054537与miR-640的表达呈负相关(r=-0.5853,P<0.05),circ_0054537与NPTX2 m RNA的表达呈正相关(r=0.5166,(P<0.05),miR-640与NPTX2 m RNA的表达呈负相关(r=-0.6802,P<0.05)。2.与HK-2细胞比较,肾癌细胞系(786-O、A498)中miR-640的表达量明显降低(P<0.05),NPTX2蛋白表达量明显升高(P<0.05)。3.双荧光素酶活性检测结果显示,共转染miR-640 mimics与circ_0054537或NPTX2野生型荧光素酶报告载体的肾癌细胞系(786-O、A498)的荧光素酶活性明显降低(P<0.05)。RIP实验结果显示,circ_0054537与miR-640的富集量明显增加(P<0.05),miR-640与NPTX2m RNA富集量明显增加(P<0.05)。circ_0054537能够负调控miR-640的表达,miR-640负调控NPTX2的表达,且circ_0054537能够通过miR-640正向调控NPTX2的表达。4.与si-circ_0054537#1+in-miR-con组比较,si-circ_0054537#1+in-miR-640组肾癌细胞系(786-O、A498)中miR-640的表达明显降低(P<0.05),NPTX2蛋白表达明显升高(P<0.05),细胞OD值、Ed U阳性率、迁移数、侵袭数及细胞中BCL2蛋白表达均明显升高(P<0.05),细胞凋亡率和细胞中BAX蛋白表达降低(P<0.05)。5.与miR-con组比较,miR-640组miR-640的表达量明显升高(P<0.05),NPTX2蛋白表达明显降低(P<0.05),细胞OD值、EdU阳性率、迁移数、侵袭数及细胞中BCL2蛋白表达均明显降低(P<0.05),细胞凋亡率和细胞中BAX蛋白表达升高(P<0.05)。与miR-640+pc DNA组比较,miR-640+NPTX2组肾癌细胞系(786-O、A498)中NPTX2蛋白表达明显升高(P<0.05),细胞OD值、Ed U阳性率、迁移数、侵袭数及细胞中BCL2蛋白表达均明显升高(P<0.05),细胞凋亡率和细胞中BAX蛋白表达降低(P<0.05)。结论:敲低circ_0054537通过靶向miR-640进而抑制NPTX2的表达来阻碍肾癌细胞增殖、迁移和侵袭,并促进肾癌细胞凋亡。