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研究背景：应用血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）对周围血管及冠状动脉闭塞性疾病进行基因治疗是近年来国内外研究的热点，大量用于血管生成研究的动物模型随之出现。如角膜血管生成模型、鸡胚绒毛尿囊膜模型、仓鼠颊囊模型、后肢动脉结扎模型等。由于这些模型无一例外存在自身血管，因此在应用其进行血管生成研究时很难分辨观察到的血管是“新”生成的还是组织中早已存在的。建立一种能更客观、准确地观测“新”生成血管的动物模型对评价VEGF基因的成血管作用具有重要价值。 研究目的：构建大鼠皮下聚乙烯醇海绵移植模型，建立一种能更客观、准确地观测“新”生成血管的动物模型，并将其应用于评价VEGF基因的成血管作用。 研究方法：将聚乙烯醇海绵移植于大鼠皮下，分别观察移植后5天、12天、16天、26天、30天移植海绵内血管生成及组织生长情况。对VEGF表达质粒pCMV4—VEGF,6；进行酶切鉴定；用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）的方法，以人肝癌细胞HepG2中提取的总RNA为模板，获得总cDNA，并以总cDNA为模板扩增人VEGF,21基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，双酶切后回收连接到pcDNA3.1（—）中。分别将VEGF表达质粒pCMV4—VEGF165与pcDNA3.1（—）—VEGF121转染COS—7细胞，转染上清液进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western免疫印迹分析。大鼠海绵移植术后5天，以VEGF表达质粒pCMV4—VEGF165为实验组，以空载体pCMV4为空白对照，以表达质粒pcDNA3.1（—）—VEGF121为有处理的对照，分别注射到植入的海绵内，观察转基因后7天、11天的血管生成及组织生长情况。以逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测VEGF基因在海绵组织、血清及肝组织中的表达情况；对所有海绵病理切片行苏木精—伊红（HE）染色及血管内皮细胞特异性Ⅷ因子免疫组化染色，应用计算机图像分析系统分析海绵内组 军医进惨学院硕士研究生毕业论文 中文摘要 织生长情况。以Stata软件对数据进行统计分析。 研究结果：＊)移植海绵于术后5天即可观察到移植海绵内有组织生长 及血管生成，并于移植后26天达高峰后维持在该水平。②表达质粒 PCMV。刀EGF；6s酶切鉴定正确，并成功构建人VEGF；。；基因真核表达载体， Western免疫印迹显示人VEGF；。。与VEGF；。；蛋白在真核细胞中表达。表达产 物在细胞培养上清液中存在，分子量分别为 22000Da与 17000Da左右。③) 转基因后7天VEGF；。。组海绵组织样本均可反转录扩增出明显的VEGF基因条 带，而其血清和肝组织的 RT－PCR结果为阴性。（4）转基因后 7天、11天 VEGF；。。组与空载体对照组整个海绵切片中有组织生长的海绵所占百分比分 别为 63．96士9．30％VS 49，33土8．33％；80．30土9．48％VS 69．04土9．42％叩 均＜0．05)。转基因后7天VEGF；。。组与VEGF；。；组整个海绵切片中有组织生长 的海绵所占百分比分别 63．96士 9．30％VS 53．90土 8．65％（P＜0．05）。 用论：＊)成功构建大鼠皮下聚乙烯醇海绵移植模型；枯)人VEGF；。。与 VEGF；。；基因真核表达载体构建成功并表达；O)海绵移植模型成功地观察到 VEGF基因的成血管作用，并且VEGF基因的表达局限于大鼠海绵移植模型的 注射部位，无远端效应。其中，表达质粒PCMV。个EGF；。。的成血管作用优于 pcDNA3．1(－厂VEGF；。；。