肝癌的80%～90%病因是肝细胞肝癌(HCC),并且这也是世界上最流行的癌症之一。传统的化疗在肝细胞肝癌患者中常常发展出化学抗性。苦参碱是一个传统中药的一个有效成分,也是一个被承认的可用的肝细胞肝癌药物。在本研究中,主要考察了苦参碱对于人肝细胞肝癌细胞株HepG2的治疗效果及潜在的分子机制。高剂量的苦参碱(1.0mg/mL)能够显著性(P<0.05)抑制细胞增殖达48.39±3.32%,在这种情况下可观察到细胞收缩和破坏。苦参碱处理48小时后,流式细胞学分析表明G1/G0期细胞的比例显著性增加,而S和G2/M期细胞显著性降低。上述结果表明苦参碱的加入致细胞停滞。低浓度的苦参碱(0.2mg/mL)处理后,使用流式细胞术,定量实时PCR,免疫组织化学(IHC)和western blot分析可检测到肝特异性miR-122的上调,随后是miR-122的目标基因周期蛋白cyclin G1(CG1),以及凋亡抑制蛋白Livin和Survivin的下调。综上所述,苦参碱通过在人肝细胞肝癌HepG2细胞株中恢复肝特异性miR-122的表达诱导细胞停滞和凋亡。背景与目的肝癌是一类严重的健康问题,世界卫生组织(WHO)认为它是第四大癌症死亡的最普遍原因[1]。在2009年美国有22,620起新病例及18,160起死亡与肝癌相关。中国占全世界肝癌死亡的53%。在中国超过90%的原发肝癌为肝细胞肝癌(HCC)。它是第二大重要的癌症杀手,主要是影响到在最有生产力的全盛时期的中年人群[2]。肝癌在中国发病率高,死亡率在各种肿瘤死亡人数中排第二位,是影响我国人民生命健康的主要杀手[2]。当今世界治疗肝癌的方法,临床疗效不甚理想,开发新的抗肝癌药物是我国的重要抗癌任务之一。虽然肝脏切除手术是一种合适的HCC治疗选择,但它仅仅适用于处于肝细胞肝癌早期的一小部分患者[3]。传统的化疗仍然是人类癌症的一个重要治疗策略。但是,治疗肝细胞肝癌的大部分化疗药物是有高风险副作用的细胞毒性试剂,例如阿霉素(ADM),顺铂(cisplatin),5-氟尿嘧啶(5-FU)和多柔比星(doxorubicin)[4,5]。更多地是,化学抗性在肝细胞肝癌患者中产生,在化疗治疗的长期效用上表现为一种主要的障碍[6]。作为我国的特有的药物—中药,其对肿瘤的治疗作用近年来也开始受到世界各国的重视。因此,必须发展替代性治疗方法以改进肝细胞肝癌治疗效果。目前,大量的研究证据表明细胞增殖、分化、凋亡之间的平衡或失调与肿瘤的发病相关,那么利用药物诱导肿瘤细胞凋亡可以成为肿瘤治疗的一条新路,这样就产生了一个全新的途径,可以将包括肝癌在内的肿瘤治愈。传统中药(TCM)因其5000年历史,以及在中国初级卫生保健中仍然占有重要地位而被重视。传统中药通过使用现代技术可补充西药,因而,可看到西方世界对传统中药的兴趣越来越大。豆科槐属植物苦参(SF)在中国是一种广泛使用的传统中药,用于包括病毒性肝炎,心因性心率不齐和皮肤炎症等一系列疾病中。豆科槐属植物苦参的活性成分是各种不同的生物碱,其中苦参碱已经被表征为主要的生物活性成分[8,9]。苦参碱是中药苦参的提取物,它属于苦参类生物碱,其在抗心律失常、抗肿瘤、保肝和调节免疫的作用已经得到业内认可。其抗病毒活性使其可以用于慢性乙型肝炎的治疗[10]。有报道称肌肉注射苦参碱可改善慢性乙型肝炎患者的临床症状,修复肝脏功能并使血清从HBVDNA阳性转化成阴性[11]。还有表明苦参碱具有抗纤维化活性,抑制肝星形细胞中血小板驱动的生长因子和转换生长因子β(TGF-β)作用[12]。研究表明苦参碱在抑制细胞生长和促进人白血病细胞K562分化中有效[9,13,14]。苦参碱也是SMMC-7721细胞的分化诱导因子[15]。在人类多发性骨髓瘤细胞核胃癌MKN45细胞中,苦参碱能通过扰乱细胞-细胞粘附诱导肿瘤细胞凋亡并抑制癌症转移[16,17]。另外,也有报道指出,氧化苦参碱可以抑制体外培养的人肝癌细胞增殖。从而,表明氧化苦参碱可能的作用就是抗肝细胞肿瘤,其机制可能是诱导肝癌细胞凋亡。苦参碱可能会阻止肿瘤侵袭[18,19]。因此,苦参碱能成为一种用于肝细胞肝癌治疗的有希望的替代性抗癌药物。目前,苦参碱已被用于小鼠的肝细胞肝癌治疗[7],但是,苦参碱抗肿瘤治疗的效力和潜在的分子机制,以及与人类肝细胞肝癌相关的生理学和药理学效果还没有很好地表征出来。MicroRNA(miRNA)是由18-23个核昔酸组成的非编码小RNA分子,它由长约70～80nt的单链RNA形成的茎环结构经Dicer酶加工后生成,序列高度保守,以部分或完全互补的方式结合靶mRNA分子的3’ UTR(非编码区)。miR-122a定位于人染色体的18q21.31,是特异性表达于肝脏的一种miRNA,并在肝脏总microRNA中有很高丰度,约占成年人肝脏总表达miRNAs的70%,在每个肝细胞表达在66000拷贝数以上,参与肝细胞分化、增殖、凋亡等一系列细胞内的生物学过程,有研究[20]发现在70%肝癌组织和肝癌来源的细胞系中miR-122表达下调,并且miR-122与肝癌的发生相关已经得到证实。相关研究显示,在肝癌细胞Hep3B和正常肝上皮细胞L02中利用miRNA芯片技术筛选miRNAs的表达差异,发现在Hep3B细胞中miR-122表达较低,另外,有研究表明miR-122表达水平的改变与肝癌细胞株对化疗药物的敏感性相关,而miR-122a的表达与肝癌细胞的细胞周期和凋亡的关系国内外尚没有相关研究。有研究显示[21],提高肝癌细胞系中miR-122的表达量,可显著抑制肝癌细胞的增殖并对凋亡有促进作用,然而抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡的具体作用机制,及其作用靶点目前还不得而知,需要继续研究。本研究中,苦参碱关于人类肝细胞肝癌细胞株HepG2的治疗效果和潜在的分子机制得到研究,我们设计实验以HepG2肝癌细胞株作研究对象,利用分子生物学和生物化学的研究方法,主要对苦参碱对肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响作研究,并研究了苦参碱对肝特异性miR-122在HepG2细胞系的作用,包括考虑到细胞增殖的抑制效果,细胞形态学的变化,细胞凋亡的诱导,以及肝特异性miR-122和其目标基因周期蛋白G1(CG1)、凋亡抑制蛋白Livin和Survivin的表达。进而探讨苦参碱诱导肝癌细胞凋亡的作用机理,为苦参碱在临床的应用提供实验依据和联合用药。方法细胞株和苦参碱处理人肝细胞肝癌细胞株HepG2(美国模式培养物保藏所(ATCC)编号HB-8064)购自中国医科大学癌症研究所(中国沈阳)。细胞用IMDM培养基(Iscove’ s modified Dulbecco’s medium)加10%胎牛血清和庆大霉素培养。苦参碱获自西安Botany Garden(中国陕西),HPLC检测纯度>99%。苦参碱储液为溶于ddH20制备为10mg/mL。对数期生长细胞以1×105细胞/mL接种,并在浓度范围从0.0(阴性对照)至1.0mg/mL的苦参碱中处理48小时。MTT试验苦参碱对细胞活力的影响通过参考文献描述的MTT试验[22]评估。简短地说,细胞以3000个细胞每孔密度铺板至96孔板中。处理结束时,去除上清,加入20μL四唑混合物,MTT,和270mL新鲜的IMDM培养基。在37℃C孵化4小时后,每孔加入120μLDMSO溶解四唑结晶。最后,使用多孔板酶标仪(Tecan,Manennedorf,Switzerland)。每个实验重复四次。结果表示为相对于未处理细胞的生长抑制百分比。显微观察消化细胞培养物(3×105细胞/mL)加入24孔板中(0.9mL每孔)并孵育12小时。然后每孔加入0.1mL苦参碱(低浓度0.2mg/mL或高浓度1.0mg/mL)。观察前细胞孵育48小时。检查细胞使用OlympusIX70倒置显微镜。流式细胞学(FCM)分析收集处于对数期的HepG2细胞至终浓度为2×105细胞/mL,并在6孔板中孵育12小时(2.7mL/孔)。然后每孔加入0.3mL苦参碱(低浓度0.2mg/mL或高浓度1.0mg/mL)用于诱导细胞,孵育48小时。同时,取0.3mL细胞培养物作为阴性对照,培养48小时,收集,用PBS洗涤,随后用70%乙醇固定。细胞离心以去除乙醇,PBS洗涤并使用碘化吡啶(PI)在暗处染色30分钟后进行流式细胞仪分析。最后,使用BD FACSCalibur(BD,USA)检测细胞周期。每个实验重复三次。凋亡检测1×106个细胞用不同浓度的苦参碱处理48小时,然后离心收集。细胞沉淀通过 DNA 降解缓冲液进行降解(10mM Tris,pH7.5,400mM EDTA,和 1%Triton X-100),再离心。得到的上清在37℃加蛋白酶K(0.1mg/mL)过夜孵育,然后用RNA酶(0.2mg/mL)孵育2小时。用酚氯仿(1:1)提取后,DNA通过2%琼脂糖凝胶电泳分离并用溴化乙锭染色后在紫外光下观察。凋亡细胞的定量评估通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶三磷酸缺口末端标记(TUNEL)法进行,该方法通过使用BD ApoAlert DNA片段试验试剂盒检查凋亡期间的DNA链的断裂。免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用高度特异亲和力纯化的多克隆抗CG1抗体进行实验。阴性对照则采用未免疫血清代替第一抗体。简而言之,部件在保湿室中与磷酸缓冲液稀释至1.5%正常羊血清中室温孵育4小时后用磷酸缓冲盐溶液中洗涤。这些部件在用终浓度为2μg/mL的抗CG1抗体孵育过夜。用含0.02%Triton X-100的磷酸盐缓冲液洗6次,每次不少于15分钟后,切片用抗生物素蛋白-生物素化的过氧化物酶复合物法(Vector Laboratories,Burlingame,CA)按照使用者指南进行免疫染色处理。组织部件在装片前用迈尔的苏木精简短地复染。培养的细胞在组织培养皿的无菌盖玻片中生长过夜,用45%丙酮/10%甲醛(溶于0.1M磷酸缓冲液)固定5分钟,然后按照上述方法进行免疫组织化学试验处理。定量实时PCR试验成熟has-miR-122(P/N:4373151)在HepG2细胞中的表达由Taqman MicroRNAAssays(Applied biosystems)按照Gramantieri等[24]作一些修正后进行分析。每个样品分析三次。逆转录反应从10ng全RNA开始,并使用环状引物。定量实时PCR在7500实时PCR系统(Applied biosystmes,USA)上使用标准Taqman MicroRNAAssays实验方案进行。20μLPCR混合物包括1.4μL逆转录产物,10μL2×taqmanUniveralPCRMaster混合液,5μL0.2μmol/LTaqman探针,1.8μL1.5μmol/L正向引物,和1.8μL0.7μmol/L反向引物。反应条件:96孔板,95oC孵育10分钟,然后以95oC孵育15秒和60oC孵育1分钟进行40个循环。基因表达相对定量的△△Ct法被用于检测miRNA表达水平。△Ct的计算为从待测miRNA的Ct减去U6RNA的Ct。△△Ct的计算为从每个样品的△Ct减去参照样品(未处理的HepG2)的△Ct。用方程2-△△Ct生成倍数变化。三种参照样品的集合用于标准曲线计算和作为参照样品的△ACt。U6RNA的Taqman MicroRNAAssays(RNU6B,P/N:4373381;Applied Biosystems)。Western blot 分析细胞裂解物用RIPAbuffer(50mmol/LTris-HCl缓冲液,pH7.4,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,1%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠)添加1Xhalt蛋白酶抑制剂混合物和1Xhalt磷酸酶抑制剂混合物(Pierce,Rockford,IL)制备。Bio-Rad蛋白分析用于确定蛋白浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜(Whatman,Boston,MA)。第一次杂交的膜用特异的第一抗体,然后用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(Cell SignalingTechnology)。蛋白条带用商业化的Immobilon Western化学发光辣根过氧化物酶底物检测试剂(Millipore,Billerica,MA)显示。转移到PVDF膜的化学发光的蛋白用ECL Plus(GE Healthcare Amersham,Piscataway,NJ)检测。相对蛋白表达值通过ImageJ软件灰度测量进行定量检定。数据分析所有的数据用软件包SPSS19.0进行分析。结果用平均值±标准差。研究的统计学显著性由参变量的非配对Student’s t检验确定。P<0.05的差异性可认为是显著的,P<0.01认为高度显著。结果苦参碱对HepG2细胞的生长抑制为检验苦参碱对HepG2细胞生长调节的效应,使用了一个苦参碱浓度范围为:0.2,,0.5,0.8和1.0mg/mL。苦参碱处理后48小时,与对照组相比,0.8和1.0mg/mL高浓度组观察到明显的细胞生长抑制,平均生长抑制率分别为44.03±4.18和48.39±3.32%。但是,低浓度苦参碱(0.2和0.5mg/mL)与对照组相比,对细胞生长没有明显影响。这些结果表明苦参碱对HepG2细胞的生长抑制效应具有浓度依赖性。细胞的形态变化苦参碱处理48小时后,用FIMS观察细胞形态。在低浓度苦参碱(0.2mg/mL)下处理的细胞与对照组相比没有表现出明显的不同;而相比对照组而言,清晰的形态变化,包括细胞收缩,破裂和破坏,均在高浓度苦参碱(1.0mg/mL)处理的细胞中观察到。高浓度苦参碱能够导致细胞群落减少,这可以从细胞屈光度下降中反映出来。通过苦参碱诱导细胞凋亡为检测苦参碱介导的细胞增殖抑制相关机制,利用流式细胞学分析评估细胞周期分布。与对照组相比,可以看到,G1/G0期细胞比例显著增加,而S和G2/M期细胞比例显著减少;用低和高浓度(0.2和1.0mg/mL)苦参碱处理后大部分细胞停留在G1期。二倍体比例略有增加而单倍体减少;另外,与对照组相比,细胞碎片大幅度增加。苦参碱对HepG2细胞凋亡的诱导作用也通过DNA碎片试验进行检验。在48小时,琼脂糖凝胶电泳表明苦参碱的处理导致HepG2细胞里DNA碎片的形成。通过TUNEL做出一个定量评估以检测DNA链断裂。与对照组细胞相比,在48小时1.0mg/mL苦参碱诱导33.1%的HepG2细胞凋亡。该结果表明,细胞用苦参碱处理引起HepG2细胞周期进程的显著性抑制,导致与对照组相比在G1期细胞百分比明显上升。苦参碱处理的细胞中肝特异性miR-122的上调为研究苦参碱处理和肝特异性miR-122表达量之间的相关性,不同样品的miR-122的相对表达量被检测。通过定量实时PCR分析确定苦参碱处理的HepG2细胞中miR-122表达量明显上调。这个上调通过提高苦参碱浓度被进一步增强,并达到峰值,约4.39倍,此时苦参碱浓度增至1.0mg/mL。苦参碱处理细胞中miR-122靶向的CG1下调免疫组织化学染色表明在低浓度(0.2mg/mL)苦参碱处理48小时后几乎所有细胞核和褐色细胞质颗粒是棕褐色。每一组的平均OD值表示CG1基因的表达水平。对照组的平均OD值是0.5367±0.0235;苦参碱处理组的值是0.3888±0.0826.苦参碱处理组的平均OD值是高显著性的,高于对照组的值,证明低浓度苦参碱足以抑制CG1基因表达。这些结果也被Westernblot实验所确认。对照组的条带比苦参碱处理细胞的要更为清晰明亮(约1.5倍)。苦参碱处理细胞中凋亡抑制基因Livin、Survivin表达下调不同浓度苦参碱作用于HepG2细胞后,随药物浓度越高,Livin、Survivin的mRNA和蛋白表达水平均越低,当苦参碱浓度为1.5mg/mL时,Livin、Survivin蛋白表达的抑制作用更显著(P<0.05)。讨论虽然传统化疗仍然是一个癌症治疗的主要方法,但癌细胞经常发展抗药性以显著降低化疗处理的效力。此外,考虑到与一些肝癌相关的贫乏的预后以及除手术之外的有限的治疗选择,患者可能会寻找替代治疗,包括传统中药产品,单独或与标准护理组合使用[1]。近几年,来自用于传统中药的药用植物的天然产物的潜力已被西方世界的科学团队所认识。许多天然产物及派生物因此列于癌症化疗的标准清单上[25]。新的传统中药获取的抗癌药物包括三氧化二砷,喜树碱,斑蝥素,高三尖杉酯碱,足叶草毒素,长春碱和长春新碱(见参考文献[25])。证据表明这些抗癌传统中药功能有1)凋亡诱导剂,通过与调节细胞增殖,血管再生或凋亡相关基因抑制细胞生长[26,27];2)免疫增强剂,促进免疫学功能或者加强对肿瘤和病毒的抵抗力[28]。本研究的结果证明苦参碱在抑制人的肝细胞癌细胞株HepG2的肿瘤细胞生长中起重要作用。苦参碱以剂量依赖性的方式降低HepG2细胞的生存。我们发现低浓度(0.2mg/mL)苦参碱足够抑制HepG2细胞生长;该细胞生长停滞为浓度依赖性,例如,当剂量增加时可观察到抑制作用提升。但是,细胞形态在低浓度(0.2mg/mL)下没有明显变化,除非剂量增加到1.0mg/mL(高浓度)。通过FCM分析检测相应的细胞周期,与未处理对照相比,时期的变化表明,随着细胞生长停滞,在苦参碱处理后48小时HepG2细胞被诱导凋亡。用MTT分析可得在低和高浓度(0.2和1.0mg/mL)苦参碱处理后,S和G2/M期部分显著性(P<0.05)降低,随后G1/G0其细胞比例增加。这些结果与苦参碱对鼠H22细胞增殖的抑制作用类似[7]。在苦参碱对鼠H22细胞的剂量作用中,使用0.5mg/mL苦参碱处理48小时发生明显的抑制,与此不同的是,在我们的研究中,在人HepG2细胞中低浓度(0.2mg/mL)作用48小时足以诱导细胞凋亡。这些结果表明低浓度苦参碱通过阻滞细胞生长以延长细胞周期来抑制HepG2细胞增殖。在本研究中细胞凋亡比例略微偏低,表明苦参碱对HepG2细胞的抑制作用主要通过细胞周期延迟(细胞生长延长和增殖减缓)而不是细胞凋亡来获得。G1/G0期细胞的明显增加和G2/M期细胞的减少暗示苦参碱对HepG2增殖的抑制作用可能主要是由于细胞在G1期停滞。但是,需要进一步的研究以确定这些结果并调查潜在的机制。肝细胞特异性miR-122通常被发现在所有肝细胞癌来源的细胞株中下调[24]。使用qPCR计数,在现在的研究中可以测定肝细胞特异性miR-122的表达量。与无苦参碱处理的HepG2细胞(对照组)相比,在所有苦参碱处理组miR-122的剂量依赖性上调证明了在人的HepG2中苦参碱和miR-122的相关性。这些线索通过Western blot分析CG1,肝细胞特异性miR-122的一个靶点,的下调进一步得到增强。低浓度的苦参碱(0.2mg/mL)抑制CG1,比对照组低1.5倍,而负相关的是miR-122的表达量提高了 1.861倍。这些结果表明抗肿瘤的传统中药苦参碱能够诱导细胞细胞停滞和凋亡,并伴随恢复人肝细胞癌HepG2细胞株中的肝特异性miR-122的表达。