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利巴韦林(Ribavirin)是一种被广泛用于治疗多种DNA和RNA病毒的药物。发酵法合成利巴韦林是利用核苷生产菌自身产生前体物鸟苷和嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,由pupG基因编码),向培养基中添加1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺(TCA)即可生成利巴韦林。本论文先对本实验室保存利巴韦林生产菌进行发酵工艺优化。生产菌Bacillus amyloliquefaciens TA208-LM是腺嘌呤缺陷型突变株,腺嘌呤浓度过低会影响菌体生长,过高又会反馈阻遏关键酶的合成。首先对腺嘌呤供体的种类和用量进行了研究,摇瓶发酵结果表明Springer 2506是最佳的腺嘌呤供体,用量在15g/L时最有利于利巴韦林积累,但发酵后期腺嘌呤浓度过高。因此在降低Springer 2506的初始浓度的基础上,额外添加腺嘌呤,结果发现初始腺嘌呤总量为47.95 mg/L时,发酵液中腺嘌呤含量维持在40～50 mg/L, PRPP转酰胺酶活力最高,合成利巴韦林的量最大。以上实验表明,控制腺嘌呤供体酵母抽提物的初始用量,在发酵过程中流加酵母抽提物可能是维持适宜腺嘌呤浓度的有效手段。在7.5 L发酵罐上对Springer 2506分批补料发酵方式进行研究,结果发现以7.5 g/L Springer 2506为底物,流加7.5g/L的Springer 2506,比一次性添加15g/L的Springer 2506,利巴韦林的积累量提高11.29%。工程菌B. amyloliquefaciens TA208-LM有一个大质粒pBSA43-pupG用来加强嘌呤磷酸化酶催化鸟苷生成利巴韦林的途径,但它会导致工程菌生长缓慢,不利于利巴韦林积累。因此,利用更小的质粒或是基因整合的方法减少菌体生长负担,并从基因水平上提高PNPase在宿主中的表达量,来提高利巴韦林产量。本论文考察PNPase质粒(pWB980)过表达和基因组整合表达对Bacillus amyloliquefaciens TA208发酵生产利巴韦林的影响。以TA208为出发菌株,利用基因过表达成功构建了胞内表达TA2081和胞外表达TA2082；摇瓶发酵结果,胞外表达TA2082比胞内TA2081更适合作为利巴韦林生产菌。以TA208为出发菌株,利用基因无标记整合技术,成功构建了TA2083；摇瓶发酵结果表明,TA2083较原菌TA208利巴韦林产量提高了58.3%,但前体物鸟苷还有大量剩余,表明基因组上pupG拷贝数不够导致PNPase酶活力不足。进一步对B. amyloliquefaciens TA208、TA2082和TA2083进行7.5 L分批补料发酵,实验表明与出发菌TA208相比,工程菌TA2082鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率从20.41%提高到98.63%,TA2083的转化率从20.41%提高到40.95%。综上所述,增加pupG的表达量能提高利巴韦林的产量,本论文为利巴韦林生产菌的代谢工程改造提供了理论依据和技术指导。