论文部分内容阅读
研究背景出血性卒中(hemorrhagic stroke)占卒中的20%-30%,但由于其起病更急,病情更凶险,病死率和致残率更高,因此临床处理更加棘手。自发脑出血(spontaneous intracerebral hemorrhage,SICH)占出血性卒中的 60%-75%,是指非外伤原因导致的脑实质内出血,临床一般简称为脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)。脑出血的病因众多,但最主要的病因是高血压病。随着人类经济社会的发展和物质条件的改善,全球范围内高血压和代谢综合征的发病率和患病率日渐升高,随之而来的便是脑出血病例的陡增,这一挑战在中国为首的发展中人口大国尤为突出。根据中国疾控中心、国家卫生健康委员会及各省流行病学数据资料显示,目前出血性卒中已是中国城乡公民首位致死原因,也是成年人致残和失能的主要原因。出血性卒中给我国公民生命健康带来严重威胁,同时给公共卫生系统和国家稳定带来巨大压力。防治以脑出血为代表的出血性卒中是我国同世界各国医务工作者和科研人员艰巨的任务。遗憾的是,脑出血目前无有效的治疗方法或药物,基于以前研究结论及临床经验的治疗方案均以失败告终。近年来,对于脑出血的病理生理研究有所进展,在此基础上的治疗方案在实验动物模型和临床上有所进步。最新的研究认为,脑出血对脑和神经功能的损害主要包括原发性损伤(primary injury)和继发性损伤(secondary injury)。脑实质内血肿造成的机械性损害为原发性损伤;血肿代谢产物的毒性、免疫损伤、氧化应激、炎症反应、神经元凋亡等属于继发性损伤。过去主张积极的神经外科手术,提高手术技艺清除血肿,但并不能显著改善患者的生存和预后。目前认为,继发脑损伤才是患者预后不良的根本原因。因此,近年来的基础和临床研究重点是预防和改善继发脑损伤。阿立新(orexin,OX)又译“食欲素”,也称下丘脑分泌素(hypocretin,HCRT),是下丘脑特定神经元分泌,广泛投射并作用于多个脑区和外周神经系统的多肽类激素,调节食欲、能量代谢、神经内分泌和睡眠-觉醒周期等多种生理过程。阿立新有A和B两种亚型,分别称为阿立新A(orexin A,OXA)和阿立新B(orexin B,OXB);阿立新的受体在中枢神经系统多种细胞表面表达,属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)家族,亦分为1和2两种亚型,分别是阿立新受体1(orexin receptor 1,OXR1)和阿立新受体2(orexin receptor 2,OXR2);阿立新A与两型受体的亲和力相等,而阿立新B主要作用于2型受体。近年来的研究表明,OX/OXR系统在神经系统多种疾病如睡眠障碍、抑郁症、物质成瘾、阿尔兹海默病、缺血性卒中的病理生理过程中发挥调节和保护作用。有学者报道,OXA能快速透过血脑屏障,通过结合其受体激活Akt依赖的细胞生存通路,发挥抗凋亡作用。此外,OXA/OXR系统还能激活下游AMPK依赖的抗炎症通路,进而抑制炎症反应。综合上述既有成果,我们推论OXA/OXR系统在脑出血继发脑损伤中能发挥脑保护作用。为此,本研究使用小鼠建立自发脑出血模型,运用神经行为学评估、脑出血大体评估和分子生物学多种手段探究OXA/OXR系统的作用及其作用机制。实验方法第一部分CD-1小鼠取自体股动脉血通过立体定向注射到基底节区建立脑出血模型,对照组采用假手术(sham)即所有操作等同于脑出血手术组,除了自体血注射。脑出血后研究断面设置在3小时(ICH 3h)、6小时(ICH 6h)、12小时(ICH 12h)、24小时(ICH 24h)、72小时(ICH 72h),利用蛋白质印迹(western blot,WB)技术分别测定OXA、OXR1、OXR2在脑出血后各个时间点的表达情况,借以明确OXA及其受体在脑出血后表达随时间的动态变化。在此急性期内选择OXA/OXR1/OXR2显著变化的时间点,利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)研究OXA/OXR在脑出血后在神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞的表达情况。第二部分使用随机手段建立Sham组、脑出血加溶剂对照组(ICH+Vehicle)、脑出血加阿立新A治疗组(ICH+OXA),探究脑出血后阿立新A的治疗效应。利用神经行为学评估和包括血肿大小定量、血脑屏障完整性评估、脑水含量测定的大体评估研究脑出血给予阿立新A治疗后CD-1小鼠的预后状况,明确OX/OXR系统是否发挥脑保护作用。第三部分将CD-1小鼠随机分成Sham组、ICH+Vehicle组、ICH+OXA组、脑出血加阿立新A再加Akt抑制剂组(ICH+OXA+MK2206)、脑出血加阿立新A再加AMPK抑制剂组(ICH+OXA+Dorsomorphin),研究阿立新A在抑制凋亡和改善炎症反应两方面的作用所涉及的分子信号通路。同时设立脑出血加阿立新A再加阿立新受体1抑制剂(ICH+OXA+SB-334867)组和脑出血加阿立新A再加阿立新受体2抑制剂(ICH+OXA+JNJ-10397049)组,探究阿立新受体的两种亚型在脑保护信号通路中扮演的角色是否有差异性。结果第一部分WB结果显示,OXA在脑组织里中等量表达,在ICH发生3h后已开始显著下降,在72小时的研究期内持续降低;相反地,OXR1和OXR2在脑组织中的含量逐渐升高。IF结果显示,OXA、OXR1、OXR2广泛表达于神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞;ICH发生后24h,OXA水平显著降低,而OXR1和OXR2水平显著升高,与WB的结果一致。第二部分与Sham组相比,ICH+Vehicle组的小鼠短期神经行为学评分显著降低,伊万斯蓝染料渗出和脑水含量明显增高,ICH+OXA组小鼠以上指标明显改善,提示OXA能明显改善神经功能、血脑屏障完整性和脑水肿。长期行为学评估的结果亦显示OXA能有效改善脑出血后小鼠的运动、感觉功能和记忆、学习等高级神经功能,表明OXA对于脑出血继发脑损伤的保护作用不只是短暂的。第三部分ICH+OXA+MK2206组凋亡指标显著升高,提示OXA的抗凋亡作用主要通过Akt依赖的信号通路;ICH+OXA+Dorsomorphin组与ICH+OXA组相比,炎症因子的表达量亦显著升高,提示OXA的抗炎作用主要通过AMPK信号通路。使用OXR1选择性抑制剂SB-334867后,OXA的抗凋亡作用被逆转,而抗炎症作用影响不显著;使用OXR2选择性抑制剂JNJ-10397049后,OXA的抗炎症作用被解除,而抗凋亡作用无明显变化。这些结果提示,OXA的抗凋亡作用主要通过OXR1受体依赖的信号通路,OXA的抗炎症作用主要是通过OXR2受体激活下游信号通路。结论1.阿立新A在脑出血后的表达显著降低,且在整个急性期(≤72h)研究期内在脑组织中的浓度逐渐降低;阿立新受体1和受体2的表达则相反,在72h研究期内逐步升高。阿立新A及其受体1/2在中枢神经系统内广泛表达,在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞都可见中等表达量。2.阿立新A能显著改善小鼠脑出血后神经功能,且这种改善覆盖短期和长期。阿立新A不改变脑出血后血肿大小,但能显著降低血脑屏障破坏程度和损伤侧脑水肿程度。3.阿立新A能显著升高p-Akt和BCL2/BAX比值,降低凋亡指标Caspase-3的表达,显示抗凋亡作用;阿立新A还能显著上调p-AMPK,降低炎症因子NFkB、IL-1β、TNFα的表达,表现出抗炎症作用。使用Akt抑制剂MK2206能有效阻断阿立新A的抗凋亡作用,使用AMPK抑制剂Dorsomorphin能有效阻断阿立新A的抗炎作用。阻断阿立新受体1能抑制阿立新A的抗凋亡作用,阻断阿立新受体2能抑制阿立新A的抗炎症作用。因此,实验结果提示阿立新A通过结合受体1,激活Akt/BCL2/BAX通路发挥抗凋亡作用;结合受体2,激活AMPK/NFkB通路发挥抗炎症作用。